云南保山稻种资源多样性初步分析

陈 蕊，李国生，王锦艳，胡凤益

(1.云南省多年生稻工程技术研究中心/云南大学农学院，昆明 650500；2.保山市农业科学研究所，云南 保山 678000)

【研究意义】遗传多样性广义上指地球生物圈所包含的遗传信息集合，狭义上指同一个种的不同种群与同一个种群内不同个体所产生的遗传变异的总和，是种内基因的变化，也称基因多样性[1]。对种质资源的遗传多样性分析可以分离鉴定出有利的性状或基因，为农作物遗传改良提供材料和基因。因此对种质资源保护和精准鉴定可以为农作物遗传改良提供有用的资源和基因。【前人研究进展】水稻是中国主要粮食作物之一，全国超过60%的人口以大米作为主食[2]。1978—1982年，在中国农业科学院作物品种资源研究所牵头开展的全国野生稻的全面考察与收集工作中，发现中国分布有普通野生稻、药用野生稻及疣粒野生稻等3种野生稻，而这3种野生稻云南皆有分布[3]，明确了云南是中国地方稻种的基因多样性中心和遗传生态多样性中心之一[4]。2005年黄燕红等对中国栽培稻6个地理分布群的遗传多样性分析表明籼稻和粳稻的平均基因多样性均以云南最为丰富,淮河上游次之,黄河以北最小[5]。保山市位于云南省西部，与缅甸接壤，总面积1.96万 km2,其中山区、半山区面积约占92%，耕地面积3310 km2，分布在海拔535.0～3780.9 m，是云南省著名的“滇西粮仓”。保山地处横断山脉滇西纵谷南端，高耸的高黎贡山和怒山山脉与深邃的怒江峡谷互相平行贯穿全境，地势北高南低、高低悬殊大，形成“一山分四季，十里不同天”的气候特点。丰富多元的气候特点造就了该地区的生态多样性和物种多样性。【本研究切入点】稻作是保山主要粮食作物之一，栽培品种在20世纪50年代前以地方良种为主，到了60年代以外引品种为主，而70年代后以引育品种为主，并逐渐形成以保粳杂系列、隆科系列、云粳系列、岫系等为主的水稻品种(康洪灿，私人通讯)。70多年来保山市农业科学研究所收集保存的1800多份稻种资源，成为云南乃至整个稻作遗传改良的重要种质库和基因库，编撰了《保山地区稻种资源志》(未发表)。但是，这些稻种资源的表型变异和遗传基础不清楚，限制了利用这些稻种资源的有利性状和基因进行稻作遗传改良。【拟解决的关键问题】从保山市农业科学研究所保存的1800多份稻种资源中随机选取96份材料，采用鉴别水稻真实性的48对SSR引物[6]进行遗传多样性分析。结合该所1987年整理编写的《保山地区稻种资源志》中记载的表型评价数据，分析保山稻种资源的生态、表型及遗传多样性。研究结果将有利于发掘保山稻种资源的有利性状/基因，为科学有效地保护保山稻种资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

从云南省保山市农业科学研究所保存的1800多份稻种资源中随机选取96份材料，包括农家种38份，农家种系统选育种6份，外引品种8份，其余44份材料无准确记载而无法区分是农家种还是改良种。96份材料中有52份材料在1987年保山农科所存档的《保山地区稻种资源志》中有表型评价记录。用抽取的96份材料进行遗传多样性分析，有表型记录的52份材料进行表型多样性分析。

1.2 种植地点

随机抽取的96份材料于2020年在水稻生产同期种植于保山市农业科学研究所试验基地。

1.3 表型评价

1.3.1 表型性状 对有表型性状记录的52份稻种资源的籼粳性、粘糯性、成熟期、粒形、茎秆颜色、颖壳颜色、颖毛多少、有无芒、米色、抗病性共10个性状进行描述性考察。性状进行赋值标准化后，对其表现型进行统计分析。

1.3.2 农艺与产量性状 对有表型性状记录的52份稻种资源的株高、产量、穗长、穗粒、有效穗、空秕率、千粒重、生育期共8个农艺性状考察。分析每个性状的最大值、最小值、均值和变异系数。同时，考察了这52份稻种资源2020年的株高。

1.4 基因型评价

随机抽取的96份材料于田间取幼嫩叶片编号后置于密封袋中，采用CTAB方法[7]提取DNA。采用水稻品种DNA分子鉴定标准(NY/T1433—2014)[6]的PCR扩增体系和鉴别方法进行遗传多样性分析。

1.5 数据统计与分析

考察的表型性状数据的平均值、标准差、变异系数等统计均用Excel 2016进行处理；用平均数配对样本T检验方法对1987与2020年的株高差异进行分析。

SSR引物的多态信息量(polymorphic information content, PIC)计算为PIC=1-Σfi2,fi表示第i个等位位点出现的频率[8]。用PowerMarker Ver 3.25统计群体总等位基因数(Number of alleles)、位点等位基因数(Number of alleles, Na)、等位基因频率(Frequency of alleles)和多态信息含量(Polymorphic information content, PIC)等参数[9]。采用PowerMarker Ver 3.25 基于Nei’s(1983)计算遗传距离的方法结合Fig Tree v1.4.3，用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)对96份稻种资源进行聚类分析[10]。

2 结果与分析

2.1 保山稻种资源表型性状变异分析

分析1987年《保山地区稻种资源志》有记录的52份稻种资源的籼粳性、粘糯性、成熟期、粒形、茎秆颜色、颖壳颜色、颖毛多少、有无芒、米色、抗病性10个性状发现：这些稻种资源分为籼粳2个亚种，籼稻为主的占86.54%，粘稻类型为主的占92.31%，糯稻类型较少；中熟和迟熟资源比例相当，分别占53.85%和40.38%，早熟资源较少，仅占5.77%；粒形以椭圆形和细长形为主，分别占比40.38%和36.54%；茎秆颜色多达6种，以褐斑杆黄色为主，占46.15%；颖壳颜色多为颖尖无色，占71.15%；有颖毛的稻种资源占98.08%；多数为无芒品种，占82.69%；具有抗稻瘟病和中抗稻瘟病的资源分别占34.62%和42.31%(表1)。说明保山稻种资源的表型性状变异具有多样性和丰富性。

表1 52份稻种资源的表型性状

续表1 Continued table 1

2.2 保山稻种资源的生态适应性

1987年有记录的52份稻种,有42份(80.8%)适应在海拔1500～1700 m种植，个别稻种资源如摆郎谷(编号21)分布最为广泛，在海拔1200～1800 m都能适应生长，而迟二芒(编号69)的种植海拔狭窄仅限于海拔1290 m左右种植。在52份稻种资源中，7份稻种资源(13.5%)分布在海拔1500 m以下地区,且全部为籼稻，80.8%分布在海拔1500～1700 m，其中籼稻38份、粳稻4份，3份稻种资源种植海拔在1700 m以上，全部为粳稻。从分布区域来看，大红谷(编号12、50、88、91)在保山辖区的2市3县均有分布，是适应性最广泛的稻种资源(表2)。

表2 52份稻种资源种植海拔与种植地区记录

续表2 Continued table 2

2.3 保山稻种资源农艺及产量性状的变异

1987年有记录的52份稻种资源的株高、产量、穗长、穗粒数、实粒数、空秕率、千粒重、全生育期的变幅分别是119～171 cm、2625～6000 kg/hm2、18～32.6 cm、77～169 粒、33～155 粒、1.9%～72%、12.3～29.15 g、157～209 d，平均数分别是143.92 cm、4431.5 kg/hm2、24.49 cm、113.86 粒、98.13 粒、15.06%、24.7 g、175.75 d，变异系数分别是8.7%、21.8%、9.4%、17.3%、21%、85.2%、10.7%、7%(表3～4)。

52份稻种资源各性状间的变异系数除株高(8.7%)、全生育期(7%)和穗长(9.4%)较小外，其他性状均较高，都在10%以上，其中产量变异系数为21.8%，穗粒数、单株有效实粒数与千粒重变异系数分别达到17.3%、21%与10.7%(表4)。研究表明，保山稻种资源的农艺与产量性状变异丰富多样，可为稻作遗传改良提供丰富的种质资源。

表3 52份稻种资源农艺及产量性状记录

续表3 Continued table 3

表4 52份稻种资源农艺及产量性状的变异分析

2.4 保山稻种资源株高的遗传变异

对1987与2020年的株高(表3～4)进行平均数配对样本T检验，结果表明1987年记录的株高与2020年调查的株高之间差异不显著(T=19.627,P<0.0001,df=51)，说明保山稻种资源的株高变异遗传具有稳定性。

2.5 保山稻种资源的遗传多样性

2.5.1 基于SSR分子标记的分析 由表5可知，对96份稻种资源进行遗传多样性检测，48对推荐引物[6]中有35对引物具有多态性，遗传多样性高达73%。具有多态性的35对引物在96份稻种资源中共扩增到100个多态性片段，根据国家行业标准(NY/T1433—2014)推荐的SSR引物分为4组，第I、II、III、IV组标记各获得26、24、26、24个多态片段，除RM176、RM561、RM567仅检测到1个等位基因，其他32对引物均可检测到2个及以上等位基因，等位基因变幅为1～6，平均每对引物可检测到等位基因数为3.14；基因多样性指数平均为0.33、变异范围为0～0.71，多态信息含量(PIC)平均为0.3、变异范围为0～0.66，而RM219、RM336、RM481、RM72、RM7102、RM3331、RM21、RM85、RM571、RM232等10对引物的PIC值均高于0.51，且等位基因数皆大于3。由此可见保山稻种资源具有较高的遗传多样性。

表5 96份稻种资源SSR标记遗传多样性分析

2.5.2 聚类分析 基于NJ聚类分析表明在遗传距离为0.4693时可将96份稻种资源划分为2大类群(图1)：第I类包含芒棒鸟嘴红(编号90)、大红谷(编号91)、硬冬谷(编号92)、拳头白(编号80)、福光(编号74)、红糯(编号64)、马背皮红(编号65)、剑川大白(编号59)、晚粳稻(编号58)、大白谷(编号57)、云香糯(编号60)11份稻种资源，仅大白谷、红糯、芒棒鸟嘴红、大红谷、硬冬谷、拳头白有表型评价记录均为籼型、无芒；第II类包含其余85份稻种资源。第II大类群中，A类遗传距离0.4456时聚到一起，是分布在1500～1800 m的大红谷(编号88)和长毛谷(编号53);B类包含王仁早(编号61)、埂子谷(63)、花禄丰(编号66)、软红(编号67)、红银丹(编号68)、迟二芒(编号69)、金果银(编号70)、灰玉5号(编号71)、红板所(编号72)、软红(73)、陇川谷(编号75)、大白谷(编号76)、花谷红(编号77)、银丹红(编号79)、巴启(编号81)、国川白(编号82)、紫秆红(编号83)、冬糯(编号84)，这18份稻种资源遗传距离0.455时聚到一起，其中有表型评价记载的有10份，2份为粳稻、8份为籼稻；C类包含其余的65份稻种资源。由此可以看出，保山现存的96份稻种资源的遗传多样性丰富。

在抽取的96份稻种资源中，记录为相同名称的云丹红(编号3、8、24)在遗传距离0.3554时分为2类(图1)，大红谷(编号12、50、88、91)在遗传距离0.4693时分为2类，细禄丰(编号20、26、78)在遗传距离0.428时分为2类，乌嘴麻线谷9(编号16、22)遗传距离为0.3663时分为2类，红糯(编号45、64)遗传距离0.4693时被划分为2类，长毛谷(编号28、55)遗传距离为0.4085时被划分为2类，软红(编号67、73)遗传距离0.4384时分为2类，以上7个在1987年的《保山地区稻种资源志》中记录为相同名称的稻种资源相对遗传距离较大；可见保山现存稻种资源在保存的过程中存在同名异种现象。而遗传距离最小的是麻线谷又叫龙大谷(编号14)和叶里藏(编号15)，遗传距离为0.0648；其次是灰谷(编号35)和FN114(编号36)遗传距离为0.1345，可见保山现存稻种资源在保存的过程中可能存在同种异名现象。

红色表示I大类，蓝色表示II大类里的A类，粉色表示II大类里的B类The red lines represent group I. The blue lines represent subgroup A of group II. The pink lines represent subgroup B of group II图1 96份稻种资源的NJ聚类Fig.1 NJ clustering of 96 rice germplasms

3 讨 论

稻种资源的遗传多样性是自然进化的结果，在与自然环境相互作用的过程中稻种遗传特性不断加强，一些优异的性状得以保存并与环境协同进化，而一些性状却也不断丢失，导致遗传多样性下降。云南保山复杂的地理气候条件形成了不同的稻种资源利用模式，丰富的民族文化习俗在一定程度上也影响着农民对稻种资源的利用，例如对糯米的偏好选择导致糯稻资源得以保存，这在一定程度上造就了保山稻种资源具有丰富遗传多样性的特点。从保山农业科学研究所保存的1800多份稻种资源中随机抽取的96份分析结果看出保山的稻种资源具有丰富的表型多样性、遗传多样性和生态适应性，为稻作遗传改良提供了丰富且重要的基因库，为有效进行作物种质资源的收集、保存和利用提供了理论依据[11]。

3.1 稻种资源保护现状

保山市农业科技部门于20世纪50、60年代先后对稻种资源进行收集整理，1979年进行了较为全面系统的收集，共收集到489个品种资源，并对这些品种资源进行了初步的整理编目，但其中有许多同名异种、同种异名的品种未进行分类归并，1985年云南省农科院对该地区稻种资源品种进行种植鉴定，对品种的来源、类型、表型性状进行考察，完成该地区稻种资源品种资料的编写(未发表)，到1987年，共收集保存了1800多份稻种资源。通过研究发现在已收集的稻种资源中，尽管前人已有关于该地区稻种资源的记录整理，但存在数据缺失严重，同名异种和同种异名现象较多，使得诸如株高、生育期、分蘖期、产量等重要形状不清楚，品质分析不足等问题。这些缺失都为该地区稻种资源的鉴定体系与评价保护造成困扰，亟待补充与完善。

3.2 保护及开发建议

随着分子生物学理论与技术的进步，从基因组水平全面分析鉴定该地区稻种资源的遗传多样性、发掘产量和品质形成的重要基因、并解析其分子机制已成为可能。

因此，有必要基于保山1800多份稻种资源30多年前历史记录信息，结合精准的表型评价与分子生物学技术，深入评价其遗传多样性，建立保山稻种资源保护体系，挖掘资源中蕴含的优异基因，结合生产需要创制生产亟需的新种质。为选育高产稳产、性状优良、品质突出的稻作品种提供有力支撑[12]。

4 结 论

从保山市农业科学研究所保存的1800多份稻种资源中随机选取96份材料，用农业行业标准(NY/T 1433—2014)公布的水稻品种DNA分子鉴定48对SSR引物进行基因型评价，并结合该所33年前(1987年)记录的表型评价结果分析其多样性。结果表明保山市农科所保存的稻种资源表型变异具有多样性、遗传变异丰富，是稻作遗传改良的重要基因库，有必要深入开发利用这些重要的稻种资源。