甘蔗野生近缘种遗传多样性的ISSR分析

徐 荣，徐永艳，何丽莲，杨清辉，张汉尧，李富生

(1.玉溪师范学院，云南 玉溪 653100；2.西南林业大学，昆明 650224；3.云南农业大学，昆明 650201)

【研究意义】甘蔗(SaccharumofficenarumL.) 是多年生禾本科(Gramineae)高效C4植物，不仅是中国主要的糖料作物，还可用于饲料、造纸及生物质燃料的生产等。目前，甘蔗品种优良亲本材料重复利用造成遗传基础狭窄，不可避免出现杂交近亲化、网络化，随着距离野生种的代数越来越远，品种生活力、适应性、抗逆性、宿根性随着世代数增加逐渐退化[1]。【前人研究进展】为了扩大甘蔗异质性，斑茅、蔗茅、芒属、高粱、玉米、竹属等被各国甘蔗育种家应用于甘蔗远缘属间杂交。 甘蔗属割手密具有适应性强、宿根性好、抗逆性强的优点，历来为甘蔗遗传改良的重要种质资源[2-4]。斑茅具有粗生、宿根性好、抗旱、抗寒、抗病、抗虫、染色体数较少、生物量大、纤维含量高等特点[5-6]，越来越受到国内外甘蔗育种界的重视。蔗茅具有抗寒、抗旱、耐瘠、宿根性强、抗锈病等特性，且易开花、花粉量极多，也是甘蔗育种[7-8]珍贵的种质资源。甘蔗属与蔗茅属、芒属、硬穗茅属、河八王属组成“甘蔗属复合体”。【本研究切入点】甘蔗属及其近缘属种之间的系统发育关系并不完全明确。ISSR (Inter-simple sequence repeats)分子标记具有操作简便、稳定性好的特点，已广泛应用于物种分类、品种鉴定及遗传多样性等方面[9]。【拟解决的关键问题】对44份甘蔗野生近缘种无性系材料进行ISSR遗传多样性分析，以期搞清甘蔗野生近缘种间的系统发育关系，为下一步种质资源创新、培育甘蔗新品种等提供种质材料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料种植于云南农业大学甘蔗所野生种质资源圃，包括甘蔗近缘植物5个属8个种共计44份无性系材料(表1)[10]。

表1 44份供试材料及来源

续表1 Continued table 1

1.2 ISSR反应体系的建立与优化及引物的筛选

试验根据禾本科植物的特性，将筛选引物分别利用不同甘蔗野生种进行扩增，通过预试验，建立一套甘蔗野生种的ISSR的优化反应体系及反应程序。PCR 反应体系：模板 DNA 1 μL、dNTP (10 mmol/L) 0.6 μL、引物(10 μmol/L) 2.0 μL、Mg2+1.6 μL、Taq酶(2.5 μL) 0.4 μL、加ddH2O 补齐20 μL。优化后的PCR扩增程序：预变性94 ℃ 8 min;变性 94 ℃ 60 s，退火56 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 60 s，循环40个；延伸72 ℃ 6 min，保温16 ℃，4 ℃保存。

参考钱韦等[11]使用的26条ISSR引物序列加以改动，交由上海生工合成，在优化的反应体系条件下，最终筛选出13条(表2)扩增特异性高、条带清晰、反应稳定的引物用于下一步分析。

表2 13对ISSR引物碱基序列

1.3 数据统计与分析

利用VILBER LOURMAT凝胶成像系统自动扫描图像条带，以有(计为1)或无(计为0)记录相对迁移位置的等位基因。运用NTSYS分析Dice (Nei and Li)系数相似性，利用UPGMA 构建聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 甘蔗近缘植物5属8种44份材料的多态位点比率与分析

对44份甘蔗野生近缘种无性系供试材料进行了ISSR分析，13条引物扩增得到位点数为261个，其中有259个多态性位点，在属的水平上99%为多态性位点，条带长度在100～2500 bp(表3)，表明野生甘蔗近缘种属具有较高的遗传多样性，对环境变化有较强的适应能力。其中,引物UBC808、UBC809扩增电泳结果见图1～4。

表3 13对ISSR引物对44份样品材料的扩增位点统计

图1 引物UBC808的ISSR扩增结果(材料A1～A24)Fig.1 Results of ISSR amplification by primer UBC808(Samples：A1-A24)

图2 引物UBC808的ISSR扩增结果(材料A25～A44)Fig.2 Results of ISSR amplification by primer UBC808(Samples：A25-A44)

图3 引物UBC809的ISSR扩增结果(材料A1～A24)Fig.3 Results of ISSR amplification by primer UBC809(Samples：A1-A24)

图4 引物UBC809的ISSR扩增结果(材料A25～A44)Fig.4 Results of ISSR amplification by primer UBC809(Samples A25-A44)

对44份材料按种属统计各自的扩增条带、多态性条带及其多态位点比率(表4)，对比分析发现不同属之间的多态位点比率在55.56%～98.98%，属间多态位点比率大小顺序排列为：甘蔗属>蔗茅属>芒属>金茅属>河八王属；与总的多态位点比率相比，种属间的多态位点比率相对小了许多，属间差异明显大于种间差异。不同种之间的多态位点比率在55.56%～96.91%，其中河八王属河八王种的多态位点最低为55.56%，蔗茅属蔗茅种的多态位点最高为96.91%，说明蔗茅属蔗茅种具有很高的遗传多样性，适应环境的能力最强。以上各近缘种多态位点比率变异系数变幅较大的为甘蔗属的割手密种，斑茅种次之，种的水平多态位点比率大小排列顺序为：甘蔗属割手密种>甘蔗属斑茅种>蔗茅属蔗茅种>芒属五节茅种>金茅属金茅种>河八王属河八王种，其中蔗茅属的滇蔗茅种、芒属的金茅种样品数量太少，不具有说服力。

表4 44份样品材料的多态位点统计

2.2 甘蔗近缘植物5属8种44份材料的Nei指数(h)分析

对44份供试材料用Nei & Li方法两两比对获得遗传相似系数，相似系数越大说明亲缘关系越近；反之，亲缘关系越远。44份材料遗传相似系数为0.1250 000～0.7096 774，平均为0.3818。采自西藏察隅的蔗茅材料90-31和材料90-29之间相似系数最大为0.7097，采自四川攀枝花的割手密材料91-2与井研的河八王材料83-199之间相似系数最小为0.1250，说明该两个材料之间的亲缘关系最远(图5)。

图5 44份材料遗传相似系数百分比Fig.5 The genetic similarity coefficient percentage of 44 samples

甘蔗野生近缘种属之间的相似系数集中在0.2～0.4，占比高达70%，遗传相似系数在0.7以上的仅占0.2%，表明各种间材料遗传分化较大，遗传多样性丰富，亲缘关系相对较远。

2.3 甘蔗近缘植物5属8种44份材料的UPGMA聚类分析

根据Nei’s遗传距离利用UPGMA构建出甘蔗野生近缘5属8种44个材料的UPGMA居群遗传关系聚类图(图6)，12个斑茅种材料在接合线0.805处聚合，金茅的2个材料与斑茅的亲缘关系更近，在接合线0.775处10个割手密材料聚合，斑茅、割手密、金茅在接合线0.74处聚合，5个五节茅材料在接合线0.755处聚后同川茅90-27在0.745处聚在一起，完全符合芒属的传统分类，11个蔗茅材料在接合线0.761处聚合后同2个河八王材料于接合线0.734处聚合在一起，芒属、蔗茅属、河八王属在0.723处聚在一起，说明蔗茅属、芒属、河八王属之间的关系更亲近，而割手密、斑茅、金茅之间的关系更近，如果斑茅划归甘蔗属，那么金茅也要划归甘蔗属，该试验的聚类结果同传统分类基本吻合。采自同一地理区域(西藏察隅)编号30、32的2个蔗茅材料紧密聚合在一起，说明遗传距离跟地理距离密切相关。

图6 44份材料的UPGMA聚类结果Fig.6 UPGMA clustering results of 44 samples

44份材料中的17份材料共扩增得到21条特异带，除个别有2条特异带外，基本每个材料只扩增到1条特异带，如采自云南潞西的斑茅材料89-8有2条特异带，UBC808的200 bp处和UBC855的990 bp各有1条，通过特异条带，有助于跟踪识别杂交后代中究竟有哪个种的血缘。

3 讨 论

基于ISSR分子标记对44份甘蔗野生近缘种材料按种间、割手密、斑茅3个层次进行遗传多样性分析，多态性位点百分率在属的水平上高达99%，表明野生甘蔗近缘种属具有较高的遗传多样性，对环境变化有较强的适应能力，为甘蔗的遗传育种改良提供了理论依据。种间水平以蔗茅属蔗茅种的多态位点最高，为96.91%，说明其具有很高的遗传多样性，适应环境的能力最强。研究结果表明属间的多态性明显高于种间的多态性，这与样本数量有很大关系，一般来讲样本数量越多，则多态位点的比率越高，样本数量少，则多态位点的比率越低。同时，研究发现含(AC)n、(CT)n、(CA)n、(GA)n序列的ISSR引物扩增多态性较高，暗示着甘蔗野生近缘种基因组中(AC)n、(CT)n、(CA)n、(GA)n含量丰富。甘蔗野生近缘5属8种44个材料聚类结果显示，不同实验材料首先按照种聚合在一起，随后按属接合在一处，割手密、斑茅、金茅之间的关系更近，而蔗茅属、芒属、河八王属之间的关系更为亲近，该聚类结果与传统分类基本吻合，说明ISSR分子标记可以用于种间遗传多样性分析。种内水平的聚类分析表明地理距离近的材料其遗传距离也近，而与生境、海拔等因素则未表现出密切的相关性。值得注意的是编号29采自美国的IND81-46蔗茅单独成一类。

斑茅的分类地位在国内甘蔗界和植物学界并没有统一，有的将其归入甘蔗属，有的则将其归入蔗茅属，甚至建议立为单种属[12]。 在国外，早期斑茅归类于甘蔗属，学名为SaccharumarundinaceumRetz。直到1925年Jeswiet提出将斑茅归类为蔗茅属，学名为Erianthusarundinaceum(Retz) Jeswiet[13]， Dtn-R 和 Rao[14]研究进一步验证了Jeswiet的观点。1972年Grassl建议把斑茅和蔗茅属内的13个种划分出来成立新的Ripidium属。Daniels和Roach于1987年将Ripidium属重新划归蔗茅属，归类为蔗茅属的一个组(Erianthussect.Ripidium)，现在国际上己基本得到承认[15]。周耀辉认为国外甘蔗界将斑茅归入蔗茅属(Erianthus) 已没有什么争议[16]。但查阅相关文献及权威网站发现，包括NCBI都将斑茅统一归类在甘蔗属内，学名通用为SaccharumarundinaceumRetz。在国内，斑茅的分类的确不统一，首先是国内没有Ripidium组的6个种，国内分布的4个蔗茅属原种中滇蔗茅、蔗茅与斑茅差异较大，无法据此确定斑茅的分类地位。周耀辉[16]将甘蔗属、蔗茅属某些种分别与斑茅进行形态学比较，建议斑茅归类在蔗茅属更加客观合理，而不应该归类于甘蔗属。廖兆周等利用过氧化物酶同工酶的方法对甘蔗属5个种216个材料进行分析，发现斑茅的同工酶带数、迁移率及其分布规律均异于甘蔗属其他4个种，认为斑茅划归甘蔗属不合理[17]。余爱丽等[18]利用ISSR标记分析了甘蔗属、斑茅、蔗茅和五节芒的亲缘关系，表明斑茅与蔗茅的亲缘关系比甘蔗属更近一些。通过研究表明，芒属、蔗茅属、河八王属之间的关系更近，而割手密、斑茅、金茅之间的关系更近。根据研究结果将斑茅归入甘蔗属较为合理。

4 结 论

利用ISSR分子标记按照割手密种内、斑茅种内及种间3个层次对44份甘蔗野生近缘种材料进行遗传多样性分析，从26条ISSR引物中筛选出13条特异引物，44个种间材料的多态性百分率为99%，扩增出的261条条带中259条为多态性条带；种间多态性为甘蔗属割手密种>甘蔗属斑茅种>蔗茅属蔗茅种>芒属五节茅种>金茅属金茅种>河八王属河八王种；44个种间材料UPGMA聚类结果基本符合形态学分类，12份斑茅材料在0.805处聚合，斑茅和割手密材料在0.775处聚合，采自西藏察隅编号A30、A32的蔗茅紧密聚合，蔗茅属、芒属、河八王属之间关系更近，与甘蔗属在0.73处聚合在一起，种间遗传相似系数在0.125～0.710。研究结果可为甘蔗遗传育种、引种等提供理论上的指导。