肿瘤蛋白翻译控制1的反义RNA 1在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2022-04-04张龙王瑞赵佳

安徽医药 2022年4期

张龙，王瑞，赵佳

肺癌早期缺乏明显临床症状，易复发和转移，五年生存率依然较低［1-3］。探究肺癌发生发展的分子机制可为其治疗提供分子靶点［4-6］。肿瘤蛋白翻译控制1（TPT1）的反义RNA 1（TPT1-AS1）是一种在胃癌［7］、上皮性卵巢癌［8］等肿瘤中表达升高的长链非编码RNA（lncRNA），其促进这些肿瘤的发展进程。然而，TPT1-AS1 能否影响肺癌的发生发展还未知。Starbase 生物信息软件预测显示，TPT1-AS1 可能与微小RNA-671-5p（miR-671-5p）结合。miR-671-5p在肺癌组织中表达下调，可作为肺癌诊断的生物标志物［9］。本研究以TPT1-AS1/miR-671-5p轴为切入点，探究了肺癌发生发展的分子机制，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料46 例肺癌组织和对应癌旁组织取自于2017 年1 月至2018 年12 月在信阳市中心医院确诊并行手术治疗的肺癌病人，其中男28 例，女18例，年龄（63.25±8.76）岁；肺腺癌21 例，肺鳞癌25例。纳入标准：（1）经病理确诊为非小细胞肺癌病人；（2）术前未进行放疗、化疗。病人知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 试剂A549 细胞系，中国科学院上海细胞库；BCA 蛋白检测试剂盒、RPMI 1640 培养基、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒、MTT 和LipofectamineTM2000 试剂盒，北京索莱宝；PCR 实验相关试剂盒，大连宝生物工程有限公司；胎牛血清，浙江天杭；引物序列、TPT1-AS1小干扰RNA（si-TPT1-AS1）和过表达载体（pcDNA-TPT1-AS1）、小干扰RNA阴性序列（si-NC）、空载体（pcDNA）、TPT1-AS1野生型（WT）和突变型（MUT）荧光素酶报告载体、miR-671-5p 模拟物（mimcs）、抑制剂阴性序列（anti-miR-NC）、miR-671-5p抑制剂（anti-miR-671-5p）、模拟对照序列（miR-NC），上海吉玛制药技术有限公司；蛋白质印迹实验所需抗体，美国Santa Cruz公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测组织中TPT1-AS1 和miR-671-5p 表达组织中总RNA 经Trizol试剂提取后，逆转录互补DNA（cDNA），行PCR扩增。扩增程序：先设置温度为95 ℃，进行预变性处理，时间为10 min。然后95 ℃条件下变性30 s，之后设置温度为58 ℃进行退火，时间为30 s；最后再设置温度为72 ℃进行延伸，时间为30 s，循环此过程，共35 个循环。引物序列见表1。2-ΔΔCt法计算组织中TPT1-AS1 相对GAPDH、miR-671-5p 相对U6 的表达量。

表1 引物序列

1.3.2 细胞培养和转染用完全培养基（含10 %FBS的RPMI 1640培养基）培养A549细胞。将A549细胞接种于6 孔板中，每孔接种细胞数为1×105个。培养12 h 后，将LipofectamineTM2000 试剂分别与si-NC（si-NC 组）、si-TPT1-AS1（si-TPT1-AS1 组）、pcDNA-TPT1-AS1（pcDNA-TPT1-AS1 组）、pcDNA（pcD-NA组）、共转染si-TPT1-AS1与anti-miR-NC（si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 组）、si-TPT1-AS1 与anti-miR-671-5p（si-TPT1-AS1+anti-miR-671-5p 组）混合均匀，取100 μL 混合液缓慢加至6 孔板中，孵育细胞6 h。然后利用RT-qPCR 法检测细胞中TPT1-AS1 或miR-671-5p表达，验证转染效果后用于后续实验。

1.3.3 双荧光素酶报告基因实验将A549 细胞接种于6 孔板中，每孔接种细胞数为1×105个。培养12 h 后，将LipofectamineTM2000 试剂分别与TPT1-AS1-WT 和miR-671-5p mimic（或miR-NC）、TPT1-AS1-MUT 和miR-671-5p mimic（miR-NC）混合均匀，取100 μL 混合液缓慢加至6 孔板中，孵育细胞6 h。然后收集细胞细胞并裂解，3 500 r/min 离心10 min。取20 μL 上清液，将其与100 μL 1×萤火虫或海肾荧光素酶反应工作液混合均匀，检测萤火虫或海肾的荧光强度。细胞荧光素酶活性=萤火虫荧光强度/海肾荧光强度。

1.3.4 MTT 检测细胞增殖将各组转染细胞接种于96 孔板中，每孔接种细胞数为2.5×104个。同时设对照组：接种未进行转染的A549细胞。培养24 h后，取5 g/L 的MTT 加至各孔（20 μL/孔），将细胞孵育4 h。弃培养基，加二甲基亚砜（150 μL/孔），反应5 min，振荡均匀。将96 孔板放入酶标仪检测卡槽中，设置λ 为490 nm，测各孔吸光度（A）值。存活率（%）=A实验组/A对照组×100%。

1.3.5 Transwell 检测细胞迁移和侵袭迁移：取100 μL 各组转染细胞加至Transwell 小室上室，每室细胞数为1.0×104个。另取500 μL 完全培养基加至下室。培养24 h 后，弃培养基，将下室细胞依次固定、染色后，显微镜观察，拍照并计数。侵袭：将Matrigel 基质胶均匀地铺在Transwell 上室，待其干燥后，按照迁移实验的步骤操作。

1.3.6 蛋白印迹法检测细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、基质金属蛋白酶（MMP）-2 和MMP-9 蛋白表达各组细胞中总蛋白经RIPA 试剂提取后，用BCA法定量，然后用SDS-PAGE实验分离。将分离蛋白转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h。于4 ℃冰箱中分别用CyclinD1（1∶800）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 500）一抗孵育，过夜后洗膜。再置于山羊抗兔二抗（1∶5 000）中，37 ℃孵育1 h。加显影液显影，曝光拍照。

1.4 统计学方法用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。实验数据均符合正态分布，以表示。癌旁组织和癌组织中TPT1-AS1 和miR-671-5p 表达量的比较采用配对t检验；肺腺癌组和肺鳞癌组TPT1-AS1和miR-671-5p表达量的比较及荧光素酶活性检测结果的比较用独立样本t检验；对照组、si-NC 组、si-TPT1-AS1 组、si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 组和si-TPT1-AS1+anti-miR-671-5p 细胞存活率、迁移数和侵袭数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达的比较均先用单因素方差分析，然后再用LSD-t检验进行组间两两比较。肺癌组织中TPT1-AS1 和miR-671-5p 表达的相关性采用Pearson 相关性分析。差异有统计学意义以P＜0.05表示。

2 结果

2.1 TPT1-AS1 和miR-671-5p 肺癌组织中的表达46 例肺癌病人癌组织中TPT1-AS1 表达量为1.88±0.12，较癌旁组织TPT1-AS1 表达量1.01±0.08显著升高（t=38.37，P＜0.05）；癌组织中miR-671-5p表达量为0.45±0.04，较癌旁组织中miR-671-5p 表达量1.01±0.06显著降低（t=46.14，P＜0.05）。

2.2 不同病理分型肺癌组织中TPT1-AS1 和miR-671-5p 的表达将46例肺癌病人分为肺腺癌组（21例）和肺鳞癌组（25 例）。肺腺癌组、肺鳞癌组病人的癌组织中TPT1-AS1 表达量分别为1.87±0.14、1.89±0.11，miR-671-5p表达量分别为0.47±0.05、0.45±0.04。两组间TPT1-AS1 和miR-671-5p 的表达比较均差异无统计学意义（tTPT1-AS1=0.54，P=0.590；tmiR-671-5p=1.51，P=0.139）。

2.3 肺癌组织中TPT1-AS1 和miR-671-5p 表达的相关性Pearson 相关性分析显示，肺癌组织中TPT1-AS1 和miR-671-5p呈负相关（r=-0.63，P＜0.05）。见图1。

图1 肺癌组织中肿瘤蛋白翻译控制1（TPT1）的反义RNA 1（TPT1-AS1）和miR-671-5p表达的相关性（线性方程：y=-0.230 65x+0.888，P＜0.05）

2.4 肺癌细胞中TPT1-AS1 靶向调控miR-671-5pTPT1-AS1 与miR-671-5p 核苷酸序列的结合位点见图2。共转染TPT1-AS1-WT 与miR-671-5p 的A549 细胞荧光素素酶活性为0.42±0.06，较共转染TPT1-AS1-WT 与miR-NC 的A549 细胞荧光素素酶活性（1.04±0.07）显著降低（t=20.18，P＜0.05）；共转染TPT1-AS1-MUT 与miR-671-5p 的A549 细胞荧光素素酶活性为0.99±0.06，与共转染TPT1-AS1-MUT与miR-NC 的A549 细胞荧光素素酶活性1.00±0.05比较差异无统计学意义（t=0.38，P=0.706）。si-TPT1-AS1 组A549 细胞中miR-671-5p 表达水平显著高于si-NC 组［（1.81±0.09）比（1.05±0.05），t=22.15，P＜0.05］，而pcDNA-TPT1-AS1 组A549 细胞中miR-671-5p 表达水平显著低于pcDNA 组［（0.40±0.05）比（1.01±0.11），t=15.15，P＜0.05］。

图2 TPT1-AS1与miR-671-5p的核苷酸序列结合位点

2.5 各组细胞增殖、迁移和侵袭能力比较si-TPT1-AS1 组A549 细胞存活率、迁移数和侵袭数较si-NC 组均显著降低（P＜0.05）。si-TPT1-AS1+antimiR-671-5p组A549细胞存活率、迁移数和侵袭数较si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 组均显著升高（P＜0.05）。对照组与si-NC 组、si-TPT1-AS1 组与si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 组各检测指标比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图3、表2。

表2 各组细胞存活率及迁移和侵袭细胞数/

注：①与si-NC组比较，P＜0.05。②与si-TPT1-AS1+anti-miR-NC组比较，P＜0.05。

2.6 各组细胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平比较CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白在si-TPT1-AS1组A549细胞中的表达量较si-NC组均显著降低（P＜0.05）。CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白在si-TPT1-AS1+anti-miR-671-5p 组细胞中的表达量较si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 组均显著升高（P＜0.05）。对照组与si-NC 组、si-TPT1-AS1 组与si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 组CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白表达量比较均差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4、表3。

表3 各组细胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平/

注：si-NC 为小干扰RNA 阴性序列组，si-TPT1-AS1 组为TPT1-AS1 小干扰RNA 组，si-TPT1-AS1+anti-miR-NC 组为TPT1-AS1 小干扰RNA 与抑制剂阴性序列共转染组，si-TPT1-AS1+anti-miR-671-5p 组为TPT1-AS1 小干扰RNA 与miR-671-5p 抑制剂共转染组，CyclinD1 细胞周期蛋白D1，MMP-2基质金属蛋白酶-2，MMP-9基质金属蛋白酶-9。①与si-NC组比较，P＜0.05。②与si-TPT1-AS1+anti-miR-NC组比较，P＜0.05。

图4 各组细胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达

3 讨论

TPT1-AS1 位于13 号染色体，其异常表达与多种肿瘤的发展进程密切相关。研究显示，TPT1-AS1是结肠癌组织中表达上调的lncRNA，与病人预后不良密切相关，其通过上调细胞中VEGFA的表达促进肿瘤血管生成和转移［10］；TPT1-AS1 宫颈癌中TPT1-AS1 呈高表达，敲减TPT1-AS1 可通过负调控miR-324-5p 抑制宫颈癌细胞的恶性行为及上皮间质转化过程，进而阻碍宫颈癌的发展进程，TPT1-AS1 有可能成为宫颈癌治疗的分子靶标［11］。本研究结果显示，肺癌组织中TPT1-AS1的表达水平显著高于对应的癌旁组织，与相关报道结果一致［12］，这提示TPT1-AS1可能参与肺癌的发生发展。

本研究通过下调肺癌细胞中TPT1-AS1 的表达发现，下调TPT1-AS1 可引起肺癌细胞增殖活性、迁移及侵袭能力均显著降低，这提示下调TPT1-AS1可能有利于延缓肺癌的发展进程，对改善肺癌病人预后具有积极作用。CyclinD1 对细胞增殖起促进作用，这与其促进细胞周期由G1 期向S 期转变有关［13］。MMP-2 和MMP-9 是能够降解细胞外基质的基质金属蛋白酶家族成员，对肿瘤细胞迁移和侵袭起促进作用［14］。本研究数据显示，下调TPT1-AS1降低了肺癌细胞中与增殖、迁移及侵袭相关的蛋白CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 的表达，与相关报道结果一致［15-16］，这进一步从蛋白水平说明下调TPT1-AS1 能够抑制肺癌细胞的恶性行为，TPT1-AS1 有可能成为肺癌治疗的分子靶点。

为了探究下调TPT1-AS1 抑制肺癌细胞恶性行为的分子机制，本研究证实了TPT1-AS1能够靶向结合并负调控miR-671-5p，这与肺癌组织中TPT1-AS1与miR-671-5p 表达呈负相关的结果一致。研究显示，miR-671-5p 是乳腺癌［17］、食管鳞状细胞癌［18］、胃癌［19］等肿瘤组织中表达降低的miRNA，其作为抑癌基因对这些肿瘤的发展起抑制作用。但也有报道称，miR-671-5p 在透明细胞肾细胞癌组织中呈高表达，发挥促癌基因作用促进该肿瘤细胞的恶性行为［20］。这表明miR-671-5p 在不同的肿瘤中发挥的作用不同。本研究显示，肺癌组织中miR-671-5p 表达下调，与Nymark 等［9］报道的结果一致，提示miR-671-5p 在肺癌中也起抑癌基因作用。此外，本研究利用恢复实验发现，miR-671-5p 表达的下调导致下调TPT1-AS1 对肺癌细胞恶性行为的抑制作用显著降低，与相关研究结果一致［21］，进一步提示TPT1-AS1 通过靶向miR-671-5p 影响肺癌细胞恶性行为，但其具体作用的miR-671-5p的靶基因还有待探究。

综上所述，肺癌组织中TPT1-AS1 表达升高，miR-671-5p 表达降低，且两者呈负相关；下调TPT1-AS1导致肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭性受到抑制，这可能与下调TPT1-AS1 引起细胞中miR-671-5p 的表达上调有关，TPT1-AS1/miR-671-5p轴可能为肺癌的治疗提供了新靶点。但本研究仅通过体外细胞实验探究了TPT1-AS1 靶向miR-671-5p 对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，接下来将通过裸鼠移植瘤实验在体内观察TPT1-AS1/miR-671-5p 轴对肿瘤生长和转移的影响，同时对miR-671-5p 靶基因及下游信号通路进行探究。

（本文图3见插图4-2）