纤维素酶处理玉米秸秆对NDF与ADF及乳酸菌数量的影响

牛彦波，安 琦，原 韬，曹亚彬

(黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010)

玉米是黑龙江省的主要农作物，其产量居于全省第一。年种植玉米面积近667万hm2[1]，因此每年玉米秸秆的产量较大。玉米秸秆在自然状态下营养价值很低，粗纤维含量高，消化率低，适口性差，作为牲畜的粗饲料品质不佳，饲喂营养价值较低，动物对秸秆采食量低。然而，玉米秸秆黄贮能够降低粗纤维的含量，改善其适口性，从而促进动物采食，提高秸秆饲料化的利用率。研究表明，黄贮可以保留秸秆中85%的养分，令秸秆多汁，柔软，适口性更佳。黄贮秸秆比干秸秆更能刺激反刍动物的食欲，促进其消化腺分泌，令反刍动物饲料采食速度和采食量分别提高43%、20%[2]。玉米秸秆黄贮添加酶制剂是近年来的研究热点。纤维素酶能将植物中的纤维素降解，变为更容易被动物消化的单糖物质，从而提高粗饲料的营养价值，因而纤维素酶的应用越来越广泛。添加纤维素酶后，植物细胞壁被分解，产生的碳水化合物给乳酸菌发酵提供底物，产生乳酸，不断促进秸秆发酵。1993年，赵长友等[3]研究发现，添加纤维素酶可以改善黄贮饲料的发酵品质，提高营养成分，抑制霉菌生长，防止腐败，提高窖贮的完好率。薛艳林等[4]报道，纤维素酶制剂处理黄贮小麦，可以显著降低黄贮饲料的pH值及ADF、NDF、氨态氮含量，还显著提高了LA、挥发性脂肪酸和CP的含量。但是，目前关于黄贮玉米秸秆中添加纤维素酶的效果结果并不一致，原因可能有多种，如玉米秸秆种类的差异、酶种类的差异、酶活标记不准确、黄贮时间及方式不统一等。酶制剂的应用也受到了应用条件的制约，其中温度的影响至关重要。低温条件下，酶解效果会受到严重影响，所以在应用上存在问题。利用纤维素酶降解玉米秸秆中的粗纤维水平，通过测定不同黄贮阶段NDF、ADF和乳酸菌的变化来验证纤维素酶在玉米秸秆降解中的作用。

1 材料

酶制剂：诺维信液体酶制剂，酶活10 000 U/g。玉米秸秆：由市场购买。MRS固体培养基配方：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉 4.0 g、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁 0.2 g、柠檬酸三铵 2.0 g、硫酸锰0.05 g、吐温80 1 mL、琼脂粉18 g、水1 000 ml ，pH 6.2±0.2，121℃20 min灭菌。

2 试验方法与内容

2.1 试验方法

玉米秸秆的处理方法：在自然风干后碾碎，用铡刀将其切短到 2～4 cm ，再用粉碎机粉碎至1～0.5 cm。玉米秸秆黄贮时使用2～4 cm的干秸秆。干秸秆的水分含量小于10%。

酶液的处理：取原酶液10 mL，加入到90 mL纯净水中，为含酶量10%的稀释酶液，混匀备用。

测定方法：活菌数的测定采用稀释平板法；中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)依照Van Soest等方法进行测定。

数据分析：采用Excel97-2003和SPSS Statistics 17.0数据分析软件对试验数据进行分析处理。

2.2 试验内容

2.2.1 温度对纤维素酶水解玉米秸秆的影响

采用减重法，将温度设定为15℃、30℃、45℃，振荡，pH自然，天数设定为5 d。将经过处理的干秸秆装入滤袋中，每袋加入秸秆1 g左右，用塑封机封口，编号，待用。每克秸秆样品中加入稀释后的酶液0 uL、0.5 uL、2 uL、4 uL。每个处理3个重复。将各处理样品装入不同的烧杯中，按照试验设计加入不同的酶液，补充水分至100 mL，放置于不同的环境中进行处理，5 d后将各样品停止处理，用纯净水清洗，直至水无色为止，倾去纯净水，置于80℃烘箱中烘干至恒重。

2.2.2 不同黄贮时间及不同纤维素酶添加量对样品NDF、ADF及乳酸菌的影响

每个处理秤取玉米秸秆500 g，按照酶的添加量共设计6组，每克干秸秆中加入0 ug、0.5 ug、5 ug、50 ug、500 ug的夏盛全组分纤维素酶，添加1 000 mL纯净水，混拌均匀，分装于5个抽真空密封袋中，每个处理3个重复。温度设定为常温25℃～30℃，每15 d、30 d、45 d、60 d取样测定。

3 结果与分析

3.1 温度与纤维素酶添加量对玉米秸秆的影响

从表1温度对纤维素酶水解玉米秸秆的试验与数据分析结果中发现，低温不利于纤维素酶的作用，与其他温度条件下对比，在P<0.05水平，具有显著性的差异；温度并不是越高越能促进纤维素酶的酶解，45℃与30℃的秸秆失重率之间差异不显著；研究发现在15℃的低温条件下酶解的时间会延长，但与对照之间仍存在着较显著的差异，秸秆粗纤维的降解率提高了0.5%以上，30℃和45℃与对照比存在着显著的差异，30℃时秸秆粗纤维的降解率提高了3.3%以上，45℃时秸秆粗纤维的降解率提高了5.4%以上；但在水解试验中发现，酶量增加并不与降解率呈现正相关性，数据分析显示，酶量的多少对于玉米秸秆的粗纤维降解并没有显著的差异。在添加纤维素酶4.0 uL组，30℃时酶水解能力反而高于45℃时酶水解玉米秸秆的失重率，说明酶解并没有随着温度的升高与酶量的增加而提高，反而表现出抑制反作用，所以用纤维素酶处理秸秆仅需要适量的酶量和必要的温度，而无须高酶量和相对高温条件。

表1 温度、酶量对玉米秸秆粗纤维的影响Tab.1 Effect of temperature and cellulaseon on crude fiber of corn stalk

3.2 黄贮天数与纤维素酶不同添加量对NDF、ADF、乳酸菌活数的影响

表2的结果显示了玉米秸秆在不同黄贮天数、不同纤维素酶添加酶量条件下，对NDF、ADF、与乳酸菌活菌数量的影响关系。

表2 纤维素酶不同添加量与秸秆黄贮天数对NDF、ADF与乳酸菌的影响Tab.2 Effect of cellulase of different additive amounts and yellow corn straw storage days on NDF, ADF and lactic acid bacteria

从数据分析结果来看，添加纤维素酶与不添加纤维素酶，玉米秸秆NDF与ADF有显著性的差异，添加纤维素酶后，玉米秸秆NDF与ADF在各个处理组中均有明显的降低。在第30 d的结果中，添加量达到5 ug/g、50 ug/g、500 ug/g的处理组，NDF均值分别从82.27%下降了4.87%、9.77%、26.30%，第45 d的时候，分别从81.93%下降了6.67%、11.67%、21.47%，第60 d时分别从82%下降了6.03%、10.40%、26.87%，随着添加量的增加，降解率增加。从天数来看，最初的30 d，降幅明显，第60 d时降幅变化不大，说明纤维素酶的作用与时间并不是正相关性的，它的作用是有时效性的，ADF的结果分析与NDF纤维素酶的作用能力基本一致；从不同天数与不同纤维素酶添加量对样品中的乳酸菌影响来看，酶量的增加与时间对乳酸菌的数量均有显著性差异，500 ug/g的处理组中，乳酸菌的活菌数量最高，第45 d以后活菌的数量达到了1.4×108cfu/g以上，超过同温度下其他组别1～3个数量级。说明纤维素酶的添加有效地将秸秆中的大分子物质进行了降解，小分子糖类物质的增加促进了厌氧条件下乳酸菌的活性，在开袋时闻到了比对照更大的酸香味，从侧面验证了加入适量纤维素酶促进了秸秆发酵中产酸微生物群落的繁殖。

天数数据采用LSD 分析方法，在P<0.05时，*表示差异显著。

4 讨论

通过以上研究可以确定，在玉米秸秆黄贮过程中，添加纤维素酶能够促进秸秆中粗纤维的降解，有利于产酸微生物乳酸菌的生长。随着酶量的增加，NDF与ADF的下降幅度也在增加，但这种降幅与对照相比并不具有正相关性，随着时间的延长，在45 d以后基本会处于稳定期，这应该与秸秆中营养成分的消耗有关系。如果随着黄贮时间的再延长，同等条件下，添加纤维素的组别与不添加纤维素的组别之间的差距会缩小，但缩小的幅度还需进一步的验考证。乳酸菌的数量随着酶量增加呈递增趋势，与对照相比差距极显著，数量增加了3个数量级。随着黄贮的时间延长，在同酶量水平下变化不显著，仅是同一数量级内的少量增加，这也符合微生物的生长曲线，在一定的阶段处于稳定。但纤维素酶的添加对玉米秸秆黄贮过程中产酸微生物群落的贡献是巨大的。干黄秸秆由于水分含量低，粗纤维含量高，微生物很难利用。在自然的黄贮状态下，各类微生物需要漫长的过程进行代谢降解，黄贮时间长，降解效能低，加入纤维素酶之后，可以很快提高大分子物质的降解，促进微生物对小分子物质的利用，使其中的微生物快速繁殖，大大缩短了秸秆黄贮的时间，对秸秆的饲料化应用具有促进作用。