山东某规模化猪场主要疫病抗体监测与分析

朱丽亚

摘要：目的：当前动物疫病已成为规模化养猪业发展的主要威胁之一，特别是猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征（蓝耳病）、猪伪狂犬病，已经成为目前中国养猪业危害最为严重的3种重要传染病。检测这三种疾病的免疫抗体，可及时了解猪蓝耳病及猪瘟抗体水平，尽早发现免疫是否存在不足，了解母猪群免疫状态，母猪群是否存在免疫问题及潜在的感染风险。方法：采取90头份猪的血清，进行猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等疾病免疫抗体检测，而伪狂犬进行野毒感染抗体检测。结果：（1）母猪三种疾病整体阳性率，蓝耳抗体阳性率为96.29%、猪瘟阳性率为94.81%、伪狂犬野毒抗体阳性率为14.82%。（2）不同生产阶段三种疾病的抗体阳性率，妊娠30～60d母猪蓝耳病、猪瘟、伪狂犬野毒抗体阳性率分别为97.77%、91.10%、22.23%;而妊娠60～90d蓝耳病与猪瘟抗体阳性率分别为100.00%和93.33%，伪狂犬野毒抗体阳性率为8.9%;哺乳15d母猪三种疾病的阳性率分别为91.10%、100.00%、13.33%。（3）不同生产线三种疾病的抗体阳性率，生产一线母猪蓝耳病、猪瘟、伪狂犬野毒抗体阳性率分别为100.00%、88.90%、0.00%;生产二线蓝耳病与猪瘟抗体阳性率分别为95.53%和100.00%，伪狂犬野毒抗体阳性率为4.47%;生产三线三种疾病的阳性率分别为93.33%、95.53%、40.00%。结论：本场猪瘟、蓝耳病整体疫苗免疫较好，但第三线哺乳阶段蓝耳病免疫较差，需要重新免疫，伪狂犬野毒处于低水平感染;整体猪场免疫效果比较好。

關键词：母猪;抗体;检测;分析

随着生猪养殖规模化、集团化的发展，生猪的饲养密度越来越高，这就导致猪群活动量减少、抵抗力下降。如果疾病早期发现不及时，这就导致疾病传播速度快，波及范围广;进而引起巨大的损失，阻碍了我国生猪产业的进一步发展。最近几年统计数据显示，因各种猪疫病造成的生猪死亡率占全部死亡生猪的10%以上，给我国生猪产业造成了巨大的经济损失。当前动物疫病已成为规模化养猪业发展的主要威胁之一，现今疾病的种类繁多，病原变异频繁，耐药性增强，混合感染易发等不利因素使得规模化养殖场面临重大的挑战。据农业农村部统计近期猪新传染病多达20种，其中猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病是目前中国养猪业危害最为严重的3种重要传染病。其中猪瘟与猪繁殖与呼吸综合征是《2012 国家动物疫病强制免疫计划》中的必须进行强制免疫的两种传染病，可见其重要性。

但目前猪场发病情形越来越复杂，其中主要以混合感染和继发感染的为主，很难看到猪瘟、蓝耳病、伪狂犬等病的典型病例，根据临床症状和病理解剖也很难对疾病进行诊断。可以通过实验室血清学检测来了解3种病的流行动态，再结合临床情况来初步诊断。对于伪狂犬、猪瘟，我们可以通过酶联免疫吸附试验（ELISA ）检测方法来鉴别诊断，而且 ELISA 检测方法操作简便、快速准确，目前已成为确诊疾病的有效手段。

疫苗免疫是规模化猪场防控重要动物疾病的重要手段，而影响免疫效果的因素众多，因此，抗体的监测就显得尤为重要。本次试验通过检测猪蓝耳病、猪瘟、伪狂犬野毒等疾病免疫抗体;及时了解猪蓝耳病及猪瘟抗体水平，尽早发现免疫是否存在不足，了解母猪群免疫状态;而对伪狂犬野毒进行检测，可发现母猪群是否存在免疫问题及潜在的感染风险。以便更好的指导母猪群管理工作。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集与处理

采集山东某规模猪场母猪群血清，采样方式为按照50%预期流行率、95%置信区间确定仔猪样本量，按照15%预期流行率、95%置信区间确定母猪采样量三个阶段合计为90个样本。通过耳缘静脉采血，凝血处理，分离血清后置于-20℃冰箱冻存待检。

1.1.2 主要试剂及仪器

MEDIAN公司猪瘟病毒（CSFV）抗体检测试剂盒、蓝耳病病毒（PRRSV）抗体检测试剂盒、猪伪狂犬病病毒gE（PRVgE）抗体检测试剂盒，以及每个试剂盒相对应的稀释液、洗涤液、TMD底物、终止液、阴性、阳性对照以及抗原包被板等。

酶标仪、Eppendorf移液器、恒温培养箱、全自动洗板机以及振荡器等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

将采集到的猪的血液，倾斜45°放置在37℃恒温培养箱中，静置 1～2h，待自然凝固析出血清后;吸取上清液转至新准备的干净的1.5ml离心管并编号，离心3～5min，分离血清，-20℃ 保存备用。

1.2.2 试验操作

本次试验是通过ELISA方法检测猪瘟、蓝耳、伪狂犬野毒的抗体水平，三种试剂盒在使用前，须恢复到正常温室（18～25℃），具体操作步骤如下：

（1）先将待检样品在96孔板架上摆好，从E1的位置开始S型依次排列;取出抗原包被板，拿出待检样品需要的孔条，多余的孔条密封（放入密封袋中，密封袋中加入干燥剂）后放入2～8℃冰箱保存。在记录表上记录样本的位置。

（2）样品稀释：用样品稀释液将待检样品进行40倍稀释。先在一次性稀释板上与待检样品相应的位置加入195µl样品稀释液，再在相应的位置依次加入5µl待检样品。加完后在微量振荡器上震荡10s混匀。每个样品都要更换枪头，不要稀释阴阳性对照。

（3）A1和B1的孔加入100µl无稀释的阴性对照溶液，而阳性对照位于C1和D1的位置，分别加入无稀释的阳性对照溶液100µl。避免产生气泡。

（4）从E1的位置开始，在对应的孔中加入100 µl已稀释好的样品，排枪加样，加样前在孔内吹打3次，采用倒吸法加入，避免产生气泡。

（5）盖上板盖或贴上封板膜在22～25℃（室温达不到时，放25℃恒温箱）条件下孵育30±2 min，严格计时。

（6）之后，板盖或封板膜去掉，洗涤4次。洗板机洗板：将反应板放在洗板机上，洗涤4次，最后一次在吸水纸（棉垫上放3张干净吸水纸）上拍干（吸水纸上无明显水渍，反应板底部无肉眼可见水渍，若孔内有气泡，用一次性枪头刺破，再次拍干）。手动洗板：将反应板快速翻转至水平，甩掉孔内液体至废液筒。用300µl排枪每孔内加入300µl洗液，水平轻摇5s，甩掉孔内液体至废液筒，如此反复洗涤4次。最后一次在吸水纸（棉垫上放3张干净吸水纸）上拍干（吸水纸上无明显水渍，反应板底部无肉眼可见水渍，若孔内有气泡，用一次性枪头刺破，再次拍干）。

（7）每孔必须立即加入100µl酶标抗体。避免产生气泡。

（8）盖上板盖或贴上封板膜22～25℃（室温达不到时，放25℃恒温箱）条件下孵育30±2min，严格计时。重复步骤6）。

（9）洗涤拍干后，TMB底物液立刻加入100µl/孔 ，加第一孔即开始计时。避免产生气泡。

（10）盖上板盖或贴上封板膜22～25℃（室温达不到时，放25℃恒温箱）条件下避光（盖黑色盖板或放置抽屉）孵育15±1min，严格计时。

（11）终止液加入100µl/孔，终止反应，添加顺序与TMB底物液保持一致。避免产生气泡。

（12）终止反应10min内，测量并且记录样本和对照的吸光值A650。

（13）将测量结果以Excel的形式保存，计算结果。

1.3 结果判定

CSFV：阻断率≥40.0%为阳性，阻断率≤40.0%为阴性;PRRSV：S/P值（阳性对照平均值的比值）≥0.4为阳性，S/P值<0.4为阴性;PRV gE：S/N值（阴性对照平均值的比值）>0.6为阴性，S/N值≤0.6为阳性。

2 结果与分析

2.1 猪场整体三种疫病抗体检测结果

由试验结果可知，母猪蓝耳抗体阳性率为96.29%、猪瘟为94.81%、伪狂犬野毒抗体阳性率为14.82%;而三种疫病抗体阳性率离散度分别为37.74%，21.17%，21.01%。

2.2 不同阶段三种疫病抗体检测结果

由试验结果可知，妊娠30～60d母猪蓝耳病、猪瘟、伪狂犬野毒抗体阳性率分别为97.77%、91.10%、22.23%，离散度为33.25%、23.85%、26.54%;而妊娠60～90d蓝耳病与猪瘟抗体阳性率分别为100.00%和93.33%，离散度为24.04%与4.38%，伪狂犬野毒抗体阳性率为8.9%，而离散度为14.25%;哺乳15d母猪三种疾病的阳性率分别为91.10%、100.00%、13.33%，离散度为55.94%、15.29%、22.23%。

2.3 不同生产线三种疫病抗体检测结果

由试验结果可知，生产一线母猪蓝耳病、猪瘟、伪狂犬野毒抗体阳性率分别为100.00%、88.90%、0.00%，离散度为30.87%、30.02%、5.31%;而生产二线蓝耳病与猪瘟抗体阳性率分别为95.53%和100.00%，离散度为43.64%与15.97%，伪狂犬野毒抗体阳性率为4.47%，而离散度为14.81%;生产三线三种疾病的阳性率分别为93.33%、95.53%、40.00%，离散度为38.72%、17.53%、42.89%。

3 讨论与分析

据农业农村部统计近期猪新传染病多达20种，其中猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病是目前中国养猪业危害最为严重的3种重要传染病。蓝耳病病毒可导致猪免疫系统受到印制，进而继发或混合感染其他疾病;再加上蓝耳病病毒具有高度变异的特性，使得其不断产生毒力增强的变异毒株，因此，主会场那个科学防控蓝耳病最有效的措施就是对其抗体水平进行检测。而猪瘟目前多以非典型、慢性、隐形的情况发病，一个猪场往往是全群感染，这就导致全部扑杀不现实，并且其还可进行垂直传播，进而使得其持续感染;并且高密度的饲养以及猪群流动频繁等不规范的操作，往往可导致猪伪狂犬的流行传播，其也严重影响猪场的发展与经济效益。

因此，对蓝耳、猪瘟、伪狂犬抗体水平进行免疫检测，既可以快速发现它们的感染与传播，同时还可以检测三种疾病的免疫抗体，对规模化猪场调整优化免疫程序、保证疫苗免疫效果至关重要;且可有效的评估疫病的感染压力和风险。离散度是衡量一个猪群抗体阳性率均匀度的一个重要指标，其高低可提示猪场在免疫后抗体水平的整齐度，可对疫苗免疫效果进行评估。抗体离散度要求是离散度越小越好。蓝耳病的离散度一般在35%～45%;母猪群猪瘟的离散度一般≤40%。

涂长春等研究认为猪瘟群体的免疫保护率至少要达到 85%，才能避免猪瘟的发生。而本次试验结果，猪瘟整群抗体阳性率在94.81%以上，猪瘟抗体整体离散度为21.17%，而且均低于40%;说明猪瘟免疫后的抗体整齐度较好;因此，本场猪瘟免疫效果较好。

良好猪场的蓝耳病抗体阳性率一般在70%以上。本次试验蓝耳病抗体阳性率结果为96.29%，而蓝耳病抗体整体离散度为37.74%，这提示该猪场蓝耳病阳性比较稳定，是一个良好的蓝耳病阳性稳定场;但母猪处于哺乳期15d时，其蓝耳抗体阳性虽然为91.1%，但离散度为55.94%，表明母猪在哺乳期蓝耳抗体参差不齐，但S/P值在2.5以内，这说明蓝耳病疫苗免疫时间较长，或者是免疫效果较差;第三生产线需要进行一次加强免疫。

而伪狂犬野毒抗体水平比较偏低，基本维持在14.82%左右;低于戴爱玲等在 2012～2014 年调查的闽西南地区部分规模化猪场母猪阳性率22.0%，但这也说明本猪场存在伪狂犬野毒持续感染压力和风险，但对后备猪进场前进行检测、净化以及进场后及时消毒等措施相结合，使得其一直维持在低水平的感染风险。

4 结论

本场猪瘟、蓝耳病整体疫苗免疫较好，但第三线哺乳阶段蓝耳病免疫较差，需要重新免疫，伪狂犬野毒处于低水平感染;整体猪场免疫效果比较好。由此可知，抗体水平检测在猪瘟、蓝耳、伪狂犬能够疾病的防控中有不可替代的作用。

要坚持定期开展免疫监测，评价疾病的免疫效果以及感染压力，及时调整本场的免疫程序，抗体不合格及时补免，淘汰带毒种猪，保障健康的母猪群。

参考文献

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