清肝健脾活血方对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠氧化应激的影响

潘富珍 刘 定 杨沈秋 张 禹

（1.黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001）

肝纤维化是一种慢性肝损伤过程，其持续发展可导致肝硬化、肝衰竭甚至肝细胞癌[1]。研究显示，肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化是肝纤维化主要驱动因素[2]。目前肝纤维化尚无有效治疗方法[3]，因此如何阻止肝纤维化进程具有重要意义。课题组前期研究认为，肝失疏泄，肝血瘀滞，肝病传脾，脾虚湿阻，肝肾亏损是肝纤维化病机动态变化规律，清肝健脾活血法为治疗本病的重要方法[4]。前期临床研究发现，应用大柴胡汤合鳖甲饮子化裁而成的清肝健脾活血方具有抗肝纤维化作用[5-7]，实验研究亦证实清肝健脾活血方对免疫性肝纤维化大鼠具有抗炎、抗血管重塑、减少转化生长因子-β（TGF-β）表达、促进细胞外基质（ECM）降解作用[8-10]。本研究拟观察清肝健脾活血方对四氯化碳（CCl4）诱导肝纤维化大鼠肝细胞保护作用及其对氧化应激的影响，以进一步探讨其抗肝纤维化的分子机制，现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠，雄性，体质量（150±20）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SCXK（黑）2019-004。所有动物自由饮水饮食，室内温度为20～25 ℃，相对湿度40%～60%。本实验经黑龙江中医药大学医学伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 清肝健脾活血方，药物组成：鳖甲20 g、柴胡10 g、枳实10 g、黄芩10 g、法半夏9 g、白芍15 g、川芎10 g、黄芪30 g、炒白术12 g、黄精15 g、甘草10 g、生姜5 g。所有饮片由安徽晋仁中药饮片有限责任公司提供。药物煎煮前浸泡2 h，先将鳖甲煎煮2 h，再加入其他11味药材，加10倍量水煎煮提取2次，每次1 h，合并水煎液浓缩至药物浓度（以生药量计量）为4.875 g/mL，置4 ℃冰箱备用。鳖甲煎丸（国药准字号：Z42020772）由武汉中联药业提供，临用时研末以蒸馏水配制成混悬液，浓度为0.1875 g/mL。甲醛（国药集团，批号：10014118），戊二醛固定液（雷根生物，批号：1124A17），PBS磷酸盐缓冲液（Solarbio公司，批号：1131021），CCl4（万维公司，批号：P20200520031），抗荧光淬灭剂（Solarbio公司，货号：S2100），橄榄油（山东鲁花集团有限公司）。丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒由南京建成生物技术有限公司提供，批号分别为20210402、20210406、20210601、20210601；活 性氧（ROS）检测试剂盒由碧云天生物技术有限公司提供，批号：20210601；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体由Boster公司提供，货号：BM0002。

1.3 主要仪器 德国莱卡2235石蜡组织切片机；德国莱卡TP1020-1全自动组织脱水机；上海一恒科学仪器有限公司DHG-9031A电热恒温箱；梅特勒-托利多AL204电子天平；宁波新艺SB-5200DT超声波清洗机；Thermo Fresco低温冷冻离心机；Thermo MultiSkan3酶标仪；Bio-Rad半干槽；其林贝尔水平脱色摇床；Hanna酸度计pH 211；Fluka电动组织匀浆器；海门市其林贝尔QL-902涡旋振荡仪；Thermo scientific NANODROP 2000分光光度计；天津市莱玻特瑞GFL-70电热恒温鼓风干燥箱；尼康Eclipse Ci-L显微镜；尼康Nikon DS-F12显微镜拍照系统；Moticam 3000显微摄影成像系统。

2 实验方法

2.1 分组、造模与给药 将72只SD大鼠随机分为6组，分别为正常组、模型组、鳖甲煎丸组和清肝健脾活血方高、中、低剂量组，每组12只，均予普通全价饲料喂养。采用CCl4诱导肝纤维化经典造模方法，除正常组外，其余各组大鼠予40%CCl4-橄榄油混悬液（体积比为2∶3）腹腔注射，每次按2.0 mL/kg剂量，每周2次（每周相同时间段），8周共16次，建立CCl4肝纤维化大鼠模型。正常组大鼠腹腔注射等量橄榄油。造模第2日开始，参考动物与人等效剂量原则[11]，清肝健脾活血方高、中、低剂量组大鼠每日分别灌胃给予32.084、16.042、8.021 g/kg清肝健脾活血方水煎浓缩液，鳖甲煎丸组每日灌胃给予0.925 5 g/kg鳖甲煎丸混悬液，均按1 mL/100 g体质量将药液稀释后灌胃给药，1次/d，正常组、模型组灌胃等量生理盐水，共8周。8周后随机取3只模型组大鼠肝组织做病理检查，Metavir分期均在F2以上，证实造模成功[12]。

2.2 取材 各组大鼠于灌胃第56天禁食不禁水12 h，用4%水合氯醛按10 mL/kg腹腔注射，麻醉后腹主动脉取血5 mL，4 ℃静置4 h，以离心半径10 cm，3000 r/min离心20 min，分离血清。另切取肝脏组织，于10%甲醛、戊二醛溶液，-80 ℃冰箱中保存备用。

2.3 观察指标

2.3.1 肝脏组织病理 取肝脏组织常规石蜡包埋，切片厚6 μm。HE染色方法：苏木素染液染色，冲洗，伊红染液染色，冲洗，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。Masson染色方法：组织常规脱蜡至水，入Masson复合染液5 min，入0.2%醋酸水溶液稍洗，入5%磷钨酸10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，入亮绿染色液5 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，按照Metavir病理评分标准[12]对大鼠肝脏组织病理进行分期。

2.3.2 血清ALT、AST含量及肝组织匀浆MDA、ROS、SOD水平 取大鼠血清，试剂盒法检测ALT、AST含量活性。准确称取肝组织，加入9倍体积生理盐水，剪碎组织，冰水浴制备匀浆，以离心半径10 cm，2500 r/min离心10 min，取上清，酶联免疫吸附（Elisa）法测定MDA、ROS、SOD水平。

2.3.3 肝组织α-SMA表达 取各组大鼠肝脏组织，蜡块包埋，切片，脱蜡至水，抗原修复，血清封闭，一抗孵育，二抗孵育，抗荧光淬灭剂封片，显微镜下拍照，用Image-Pro Plus 6.0图片分析系统对肝组织α-SMA进行定量分析。

2.4 统计学方法 应用GraphPad Prism 8.3.0及SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），经方差齐性检验，方差齐则采用LSD法，方差不齐则采用Games-Howell法；组间等级资料比较采用Kruskal-Wallis H检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠肝组织病理形态观察及分期比较 病理结果显示，正常组大鼠肝细胞板排列较规整，沿中央静脉呈放射状分布，胞质胞核界限较清晰，未见炎细胞浸润，未见明显的充血或水肿。模型组大鼠肝细胞板排列不规整，胞质染色不均，可见胞质融合肿胀，胞核固缩，沿血管周边肝细胞呈现中度脂肪样变性，局部可见有炎细胞聚集成堆，纤维增生，部分可见纤维间隔形成。各给药组大鼠肝组织病理改变有不同程度的改善，其中以清肝健脾活血方高、中剂量组和鳖甲煎丸组改善较为明显。各组大鼠肝脏组织Metavir病理分期比较，经Kruskal-Wallis H检验，组间差异有统计学意义（P＜0.01）。与正常组比较，模型组大鼠肝组织病理分期显著加重（P＜0.01）；与模型组比较，清肝健脾活血方高、中剂量组及鳖甲煎丸组大鼠肝组织病理分期均显著改善（P＜0.05，P＜0.01），清 肝健脾活血方低剂量组改善不明显（P＞0.05）。清肝健脾活血方高剂量组大鼠肝组织病理分期程度显著轻于低剂量组（P＜0.01）；清肝健脾活血方各剂量组与鳖甲煎丸组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1、图2。

图2 各组大鼠肝组织病理形态变化（Masson染色，×200）

表1 各组大鼠肝脏组织Metavir病理分期比较 单位：只

3.2 各组大鼠血清ALT、AST含量及肝组织匀浆MDA、ROS、SOD水平比较 与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST含量及肝组织匀浆MDA、ROS水平均显著升高（P＜0.01），SOD水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，清肝健脾活血方高、中剂量组和鳖甲煎丸组大鼠血清ALT、AST含量及肝组织匀浆MDA、ROS水平显 著 降 低（P＜0.05，P＜0.01），低剂量组AST含量、MDA水平显著降低（P＜0.01），高剂量组SOD水平显著升高（P＜0.05）。清肝健脾活血方高剂量对上述指标的改善显著优于中、低剂量（P＜0.01）；清肝健脾活血方高剂量组大鼠血清AST含量显著低于鳖甲煎丸组（P＜0.01）。结果见表2、表3。

表2 各组大鼠血清ALT、AST水平比较（±s）

表2 各组大鼠血清ALT、AST水平比较（±s）

注： 与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与清肝健脾活血方高剂量组比较，ΔΔP＜0.01。

组别 动物数/只 剂量/（g/kg） ALT/（U/L） AST/（U/L）正常组 8 - 91.92±4.76 66.33±19.36模型组 8 - 111.60±10.93** 202.78±38.09**清肝健脾活血方高剂量组 8 32.084 94.02±11.60## 80.68±18.69##清肝健脾活血方中剂量组 8 16.042 100.68±10.02#ΔΔ 105.01±19.72##ΔΔ清肝健脾活血方低剂量组 8 8.021 108.17±7.91ΔΔ 157.80±21.53##ΔΔ鳖甲煎丸组 8 0.925 5 98.97±6.19# 112.29±16.78##ΔΔ

表3 各组大鼠肝组织匀浆MDA、ROS、SOD水平比较（±s）

表3 各组大鼠肝组织匀浆MDA、ROS、SOD水平比较（±s）

注： 与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与清肝健脾活血方高剂量组比较，ΔΔP＜0.01。

组别 动物数/只 剂量/（g/kg） MDA/（nmol/mg prot） ROS相对荧光强度 SOD/（U/mg prot）正常组 8 - 1.65±0.16 1.00±0.00 332.11±49.92模型组 8 - 4.91±1.88** 1.74±0.23** 224.53±29.65*清肝健脾活血方高剂量组 8 32.084 1.69±0.54## 1.28±0.25## 322.30±47.20#清肝健脾活血方中剂量组 8 16.042 1.94±0.53##ΔΔ 1.41±0.17#ΔΔ 265.29±89.29ΔΔ清肝健脾活血方低剂量组 8 8.021 1.69±0.54##ΔΔ 1.43±0.25ΔΔ 268.63±72.17ΔΔ鳖甲煎丸组 8 0.925 5 1.76±0.74## 1.42±0.20# 315.08±50.97

3.3 各组大鼠肝组织α-SMA表达比较 正常组大鼠肝组织仅有少量α-SMA蛋白表达，模型组α-SMA蛋白高表达，各给药组表达均减少，以清肝健脾活血方高剂量组改善最为明显。与正常组比较，模型组大鼠肝组织α-SMA的相对表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，清肝健脾活血方各剂量组及鳖甲煎丸组α-SMA的相对表达量均显著降低（P＜0.01）。清肝健脾活血方高剂量组α-SMA表达显著低于中、低剂量组和鳖甲煎 丸 组（P＜0.05，P＜0.01）。 见图3、表4。

表4 各组大鼠肝组织α-SMA表达比较（±s）

表4 各组大鼠肝组织α-SMA表达比较（±s）

注： 与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与清肝健脾活血方高剂量组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

组别 剂量/（g/kg） α-SMA正常组 - 35 584.76±7 307.98模型组 - 380 859.39±38 978.18**清肝健脾活血方高剂量组 32.084 68 845.17±6 195.09##清肝健脾活血方中剂量组 16.042 109 175.61±14 410.19##ΔΔ清肝健脾活血方低剂量组 8.021 172 827.74±13 325.46##ΔΔ鳖甲煎丸组 0.925 5 93 150.54±7 103.73##Δ

图3 各组大鼠肝组织α-SMA表达（×400）

4 讨论

肝纤维化可归属于中医学“积聚”“癥瘕”“胁痛”“鼓胀”等范畴，病因病机为外感六淫、疫毒，情志失调，饮食不节，烦劳过度，引起肝失疏泄，气机不畅，郁久化热，导致湿热疫毒稽留，日久难去。肝血瘀滞既是肝失疏泄的结果，也是肝病传脾、肝病及肾导致疾病加重的重要诱因。治疗既要抓住肝失疏泄的主证，也要重视肝病传脾、肝病及肾的变化规律，同时瘀血作为肝纤维化发展过程中的重要病理因素，活血化瘀应贯穿治疗始终[13]。《素问·五常政大论》中记载：“治温以清，冷而行之……”，提出“清”法治疗疾病的概念。清代王泰林在《西溪书屋夜话录》中提出著名的“治肝三十法”，其中“清肝”法是治疗肝火类疾病的重要治法。综上，我们拟清肝健脾活血法作为肝纤维化的基本治法。清肝健脾活血方方中取咸寒之鳖甲为君药，软坚散结；以柴胡、黄芩、枳实、川芎为臣，疏肝解郁、内泻热毒；佐以黄芪、白术益气健脾，与川芎相配益气活血，与枳实相配行气活血；佐以酸苦之白芍柔肝敛阴，辛温之法半夏、生姜燥湿化痰，正如《血证论》所言之“肝体阴而用阳，此以酸甘补肝体，以辛甘补肝用”，白芍与活血之川芎相配伍养血和阴，半夏和健脾之黄芪、白术相配燥湿健脾；再佐以黄精滋阴益肾，紧扣肝纤维化肝、脾、肾三脏功能失调的病机特点，滋水涵木，达到肝脾肾同治的目的，《本草分经》有云：“黄精甘平，补气血而润安五脏……”；使以甘草健脾益气，调和诸药。诸药合用，共奏清肝泻热、益气健脾、行气活血、软坚散结之效。

研究显示，α-SMA是HSCs活化的标志[14]，而ROS被认为能诱导HSCs增殖、迁移、胶原积累和肝纤维化形成[15]。氧化应激可由ROS的增加或抗氧化剂的减少引起，来自线粒体、内质网和过氧化物酶体的ROS是慢性肝病发生发展的重要原因[16]，ROS在CCl4诱导的肝损伤和纤维化形成中起重要作用[17-18]。MDA是氧化应激标志物，可以反映机体氧化应激水平[19]，而SOD是重要抗氧化酶，具有内源性自由基清除剂功能，在慢性肝病中，SOD表达下调，使肝脏对超氧化物诱导的损伤敏感[20]，提高SOD水平可以提高细胞抗氧化能力，减轻肝细胞损伤[21-25]。

本研究通过CCl4腹腔注射建立肝纤维化大鼠模型，参照《肝纤维化中西医结合诊疗指南（2019年版）》选取治法相似的鳖甲煎丸作为阳性对照药。结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST含量及肝组织MDA、ROS活性和α-SMA表达显著增高，SOD含量显著降低，说明CCl4诱导肝纤维化模型肝细胞损伤、氧化应激、HSCs活化明显。与模型组比较，清肝健脾活血方高剂量组大鼠血清ALT、AST含量显著降低，与鳖甲煎丸组比较清肝健脾活血方高剂量组大鼠血清AST含量降低更为明显，而AST反映的是肝细胞器的损伤，ALT反映的是肝细胞膜的损伤，说明清肝健脾活血方高剂量具有更好的肝细胞保护作用。另外，清肝健脾活血方高剂量组肝组织Metavir病理分期较中、低剂量组改善更为明显，说明治疗存在剂量依赖关系，可以筛选高剂量作为后续研究的治疗剂量。本实验结果表明，与模型组比较，清肝健脾活血方高剂量组大鼠肝组织MDA、ROS水平显著降低，SOD水平增高，而鳖甲煎丸组SOD水平与模型组比较差异无统计学意义，说明清肝健脾活血方高剂量能更好地提高细胞的抗氧化应激能力。本实验结果表明，清肝健脾活血方高剂量组与鳖甲煎丸组和清肝健脾活血方中、低剂量组比较，α-SMA降低更为明显，说明清肝健脾活血方高剂量具有显著的抑制HSCs活化作用。

综上，此次实验说明，提高细胞抗氧化应激能力，抑制HSCs活化可能是清肝健脾活血方抗肝纤维化的作用机制之一，鉴于HSCs活化作为肝纤维化的中心环节，下一步将进一步通过实验研究清肝健脾活血方抑制HSCs活化的作用机制。