罗伊乳杆菌对肠屏障功能调节作用的研究进展

岑秋宇，庞日朝，胡晓敏，崔艳如，张安仁

肠道具有与外界环境接触面积大的特点，因此肠屏障在保护生物体免受病原体和外部有害物质侵害方面起着重要作用[1]。肠屏障由相互关联的4部分组成，分别是机械屏障（单层半透性上皮细胞）、化学屏障（黏蛋白和抗菌肽组成的黏液层）、免疫屏障（固有层中的免疫细胞和肠道淋巴组织）和微生物屏障（肠腔中的共生菌）。肠屏障功能障碍与多种疾病相互关联，如中枢神经系统疾病、代谢性疾病、消化系统疾病、自身免疫性疾病等[2-5]。因此，了解导致肠屏障功能改变和调节的分子机制将对相关疾病的治疗和预防起积极作用。

罗伊乳杆菌（Lactobacillus reuteri，L.reuteri）是肠道共生菌群的重要成员，Gerhard Reuter和Tomonari Mitsuoka 在20世纪60年代和20世纪70年代深入研究了人类消化道中的乳杆菌微生物群，并报告L.reuteri是人类胃肠道中的优势乳酸杆菌之一，并且经常在粪便样本中被检测到[6]。此外，L.reuteri还是一种对宿主健康有多种益处的益生菌，其可定殖于肠道，减少微生物从肠腔到肠外组织的转移，加强肠道物理屏障，也可通过产生抗菌分子，抑制病原微生物的定植，还可通过重塑宿主肠道中的微生物群组成减少促炎因子的产生、促进调节性T细胞的发育，进而保护宿主的肠道免疫系统[7]。本文针对L.reuteri的生物学特性、L.reuteri对肠屏障功能的影响及可能机制进行综述。

1 L.reuteri的生物学特性

L.reuteri是乳酸杆菌属的革兰阳性兼性厌氧菌，最早于1962年被分离出来[8]，其是一种末端呈圆形的略微不规则的弯曲杆菌[9]。L.reuteri广泛存在于人类和脊椎动物的胃肠道，其在肠道中具有很强的黏附性，常定殖于近端消化道的肠上皮细胞之上。由于肠上皮细胞是肠屏障的主要构成[10]，也就意味着肠屏障比其他组织更容易直接接触到L.reuteri。L.reuteri主要代谢产物有罗伊菌素、乳酸、醋酸、乙醇和罗伊环素等抗菌物质[9]，且前期研究已证实L.reuteri还可通过增加肠道中丁酸的含量[11]和促进色氨酸代谢物的产生[12]，在宿主肠道中发挥免疫调节的作用[13-14]。因此，了解L.reuteri对肠屏障功能的调控作用对肠屏障功能障碍相关疾病的治疗和预防意义重大。

2 L.reuteri对肠屏障的调节作用

2.1 L.reuteri对肠机械屏障的调节作用 肠机械屏障主要由肠上皮细胞覆盖组成，细胞间通过黏附连接（adherens junctions，AJ）和紧密连接（tight junction，TJ）相连，被认为是肠道旁细胞通透性最重要的决定因素[15]。L.reuteri对肠机械屏障的调节作用可通过直接影响和间接影响实现。研究发现，L.reuteri胞外存在大量脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）、黏液结合蛋白（mucus-binding protein，Mub）等黏附素。这些特异结构使得L.reuteri可黏附于回肠的黏液以及上皮细胞之上，并且定殖到宿主胃肠道后形成生物膜，直接加固肠屏障，有效减少共生菌的肠外转移。除此之外，L.reuteri还可通过刺激促肠上皮细胞以及TJ蛋白相关生长因子的表达，间接调控肠机械屏障。WU等[16]研究发现，Wnt/β-catenin信号在健康成年人组织中的功能是维持干细胞壁龛，并在小肠隐窝底部表达最高。利用每孔108CFU的L.reuteri D8处理由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠肠上皮细胞损伤模型48 h后，发现小肠隐窝底部Lgr5+细胞（肠干细胞标志物）数量增加，其机制可能为L.reuteri可通过促进R-spondins基因的表达，激活并提高Wnt/β-catenin信号强度和持续时间，促进肠干细胞增殖分化为肠上皮细胞，从而修复肠机械屏障功能。HOU等[17]研究发现使用109CFU/d的L.reuteri持续喂养27 d，可修复由右旋糖酐硫酸盐（ameliorates dextran sulfate sodium，DSS）诱导的小鼠肠上皮细胞损伤，其机制可能为L.reuteri可将膳食营养摄入的色氨酸通过吲哚-丙酮酸途径代谢为具有芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）配体活性的吲哚-3-醛（indole-3-aldehyde，IAld），从而激活AhR信号，促进白介素（interleukin，IL）-22表达，诱导信号转导转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）蛋白磷酸化以加速肠上皮的增殖。既往研究发现，蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路的激活与TJ蛋白的表达增强高度相关[18]。应用黄芪甲苷Ⅳ干预传输型小鼠便秘模型5 d后观察到小鼠的结肠转运时间以及肠道中L.reuteri的α与β多样性，并通过菌群调控的方式在结肠中产生短链脂肪酸（丁酸），后者可以为结肠转运提供动力并通过激活Akt信号通路增加TJ蛋白（claudin-1和occludin）mRNA的表达来增强肠机械屏障功能[19]。

综上所述，L.reuteri一方面可通过直接黏附于肠上皮细胞来降低细胞旁通透性，减少肠道菌群的移位；另一方面可通过刺激肠上皮细胞以及TJ蛋白的增殖改善肠机械屏障功能。

2.2 L.reuteri对肠化学屏障的调节作用 肠化学屏障由消化液中的抑菌物质、杯状细胞分泌的黏液以及Paneth细胞分泌的抗菌相关蛋白（例如黏蛋白和抗菌肽）组成[20-21]，屏障中的抑菌物质和抗菌相关蛋白可在特定部位发挥抑菌效能，保护肠道免受病原菌感染；该屏障的黏液层对于限制上皮细胞与肠腔内的细菌直接接触至关重要。研究表明，L.reuteri可通过促进抗菌物质产生以及黏蛋白的表达，加强肠免疫屏障的防御功能。XIE等[22]研究发现给予3日龄仔鸡连续口服7 d 109CFU/d的L.reuteri 22后，结果显示Notch信号通路被显著抑制，故诱导了肠道干细胞分化为具有增加黏蛋白2（mucin 2，Muc-2）表达特性的杯状细胞，另外还显著上调了溶菌酶1（lysozyme 1，Lyz1）的mRNA表达。另有研究也发现，给予3日龄新生仔猪口服5 d 109CFU/d L.reuteri后，可促进仔猪空肠中的肠道干细胞分化为杯状细胞与Paneth细胞，这些细胞的增殖显著上调了肠道黏液中Muc-2、Lyz1、β-防御素1以及抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs） mRNA的表达[13]，从而增强了肠化学屏障功能。此外，田志梅等[23]研究结果显示，给予21日龄断奶仔猪口服添加109CFU/kg的L.reuteri饲料后，其胃蛋白酶表达上调，该机制可能为乳杆菌通过降低胃肠pH值而促进了蛋白酶等消化酶的产生，且酸性环境和消化酶的产生在一定程度上可抑制或杀灭病原体，保护肠屏障不被病原体攻击，保护肠化学屏障。

综上所述，L.reuteri可以通过促进抗菌物质产生以及降低胃肠pH值抑制病原微生物的生长。

2.3 L.reuteri对肠微生物屏障的影响 微生物群在哺乳动物的肠道中定殖，形成了肠微生物屏障，这种微生物生态系统对维持肠道健康起着重要作用[24]。XIE等[25]研究结果显示，使用109CFU/d的L.reuteri干预大肠埃希菌诱导的腹泻仔猪21 d后，在门水平上，肠道益生菌如厚壁菌的比例增加，且有害菌如拟杆菌、变形菌和梭杆菌的比例降低；在属水平上，益生菌如乳酸杆菌的相对比例有所提高，而致病菌如埃希菌、志贺菌、梭杆菌和普雷沃菌等的相对比例有所降低。值得一提的是，厚壁菌已被证实是产丁酸的主要菌群，可通过拮抗核转录因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号抑制肠道炎症。另一项研究也发现，使用109CFU/d的L.reuteri I5007喂养葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠14 d后，小鼠肠道中致病菌埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属的丰度降低，结肠屏障的渗漏、黏膜溃疡、上皮水肿和炎症细胞浸润有效减轻[14]。此外，HE等[26]利用 108CFU/d的 L.reuteri DSM17938干预实验性自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠20 d后，小鼠肠道中微生物群的β多样性增加，且有益菌群如双歧杆菌、普雷沃菌和乳杆菌的相对丰度得到有效改善，平衡了肠道菌群。

综上所述，L.reuteri可显著改变肠道微生物群的组成和丰度，促进有益菌群的增殖，减少有害菌群的增殖，进而使肠微生物屏障得到改善。

2.4 L.reuteri对肠免疫屏障的调节作用 肠免疫屏障主要包括肠黏膜固有层中的免疫细胞（如树突细胞、驻留巨噬细胞、B细胞和T细胞）和肠道相关淋巴组织。肠道免疫系统可产生分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）、IL等因子[27]。L.reuteri能通过刺激相关淋巴组织促进免疫细胞因子的产生，并通过微生物代谢途径促进肠道中AhR配体和丁酸盐的产生，影响AhR、NF-κB的信号传导而调节炎性因子，加强肠免疫屏障。研究发现，L.reuteri通过调节大鼠回肠集合淋巴结（peyer's patch）中树突细胞的功能，刺激B淋巴细胞产生sIgA，此外，其还通过调节肠道微生物群和乳杆菌的多样性，预防肠道炎症[28-29]。WANG等[13]研究发现，使用L.reuteriD8饲喂日龄仔猪5d后，仔猪空肠中CD3+T细胞数量和血清中IgG抗体、IL-4水平显著上升，促进了Th1辅助细胞产生γ干扰素（IFN-γ），而这些物质可调节肠道免疫系统，抵御病毒和细菌感染发生。WANG等[14]研究发现，使用109CFU/d的L.reuteri I5007喂养DSS诱导的结肠炎小鼠14 d后，产丁酸盐菌丰度增加，进而促进丁酸盐的产生。丁酸盐可结合并激活过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs），拮抗NF-κB信号通路，从而在肠道中产生抗炎作用，具体表现为可降低促炎细胞因子干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-8的mRNA表达情况，上调IL-10和转化生长因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）的表达情况[30-31]。此外SINGH等[32]研究发现，L.reuteri可通过促进丁酸盐的产生刺激其下游靶基因G蛋白偶联受体109A（G protein coupled receptor 109a，GPR109A）的表达，而丁酸可作为其配体直接激活该受体从而抑制NF-κB信号通路的磷酸化，促进结肠巨噬细胞和树突细胞的抗炎作用，并使二者能够诱导调节性T细胞的分化和结肠上皮中IL-18、IL-10的表达，并通过促进这些抗炎基因和免疫细胞的表达加强肠免疫屏障。CERVANTES-BARRAGAN等[33]在体外研究中发现，L.reuteri释放的罗伊素和组胺可以将肠道中的色氨酸代谢为吲哚衍生物如IAld、吲哚-3-乳酸（indole-3-lactic acid，ILA）等，这些物质可充当AhR配体激活AhR信号通路，将肠固有层内的CD4+T细胞重新编程为免疫调节T细胞，改善炎症性肠病小鼠的肠屏障功能障碍。另一体外实验发现，将10 μg的L.reuteri CO21裂解液预处理4 h后可减轻由LPS诱导的IPEC-J2细胞炎症，其机制可能为L.reuteri CO21通过抑制Toll样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）介导的NF-κB信号通路，并抑制其下游炎性因子如IL-1β、IL-12、IL-6和TNF-α的表达，上调IL-10的表达，以减轻由LPS诱导的IPEC-J2 细胞炎症[25]。

综上所述，L.reuteri可以促进免疫细胞因子的产生，并通过调控肠道菌群代谢产物激活AhR、NF-κB等信号通路，刺激其下游抗炎相关蛋白的表达，进而增强肠免疫功能。

以上研究表明，L.reuteri在改善受损肠屏障功能方面表现出独特的优势和巨大的潜力，其机制可能为：首先，L.reuteri通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进肠干细胞增殖分化为肠上皮细胞，并通过激活Akt信号通路促进TJ蛋白的产生，修复机械屏障；其次，通过抑制Notch信号通路以诱导肠道干细胞分化为杯状细胞与Paneth细胞，促进Muc-2、Lyz1、β-防御素1以及AMPs等抗菌物质的表达，保护化学屏障；再次，通过促进sIgA的产生以及将肠道中的色氨酸转化为AhR配体激动剂，激活AhR信号通路将CD4+T细胞重新编程为免疫调节T细胞，增强肠道免疫力；最后，通过平衡肠道菌群促进丁酸盐的产生和GPR109A的激活，抑制TLR4、PPARs的激活，拮抗NF-κB信号通路，从而抑制促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、IFN-γ的表达，上调抑炎细胞因子IL-10、IL-18、TGF-β的表达，改善肠道炎症，加固免疫屏障与微生物屏障（图1）。

图1 L.reuteri对肠屏障作用机制图Figure 1 The mechanism of action of Lactobacillus reuteri on intestinal barrier

3 小结

综上所述，L.reuteri可通过修复肠道完整性、恢复黏膜层厚度、重建细菌稳态和平衡炎性因子等途径来调节受损的肠屏障。希波克拉底曾言：“所有疾病都起源于肠道”。近年来，肠道菌群及肠屏障领域越来越受关注，且大量研究提示从微生物角度出发可能是治疗各种肠道疾病的重要途径[34-36]。L.reuteri作为哺乳动物和脊椎动物肠道中最常见的乳酸菌已被证实在动物体内可参与多种代谢途径，并通过这些代谢途径调控肠屏障功能，从而保证机体健康。尽管在动物实验中得出L.reuteri具有较高的理论研究意义和应用价值，但其在临床中的应用范围还很局限，多集中于便秘、腹泻、婴儿肠绞痛、幽门螺杆菌感染、牙周炎等疾病，且L.reuteri在实际应用中的最佳菌株、干预剂量、干预时间、用法（单用或联合其他菌种）等还尚不十分明确。因此，未来还需要设计大量多中心、大样本的临床研究以明确L.reuteri对人体肠屏障功能障碍相关疾病的影响与作用。此外，要进一步探索L.reuteri改善肠屏障功能的调控途径和关键靶点，为肠屏障功能障碍相关疾病的预防、早期干预和治疗提供新思路。

作者贡献：岑秋宇提出研究选题方向，进行论文的构思与设计、文献及资料的整理，并撰写论文初稿；崔艳如负责检索和汇总文献及资料；胡晓敏对初稿进行修订；庞日朝、张安仁负责论文的质量控制及审校，对论文整体负责；所有作者确认了论文的最终稿。

本文无利益冲突。

本文文献检索策略：

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