定量核磁共振法测定甲磺酸伊马替尼质量分数

苏 凤,汪一帆

(浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014)

甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate),商品名格列卫,是一种由诺华公司开发的酪氨酸激酶抑制剂[1]。2001年5月,甲磺酸伊马替尼经FDA的批准在美国上市,2002年在中国正式销售,作为费城染色体阳性慢性粒细胞白血病加速器、急慢性和α-干扰素治疗失败后的首选治疗药物[2-7]。甲磺酸伊马替尼作为一种有机酸盐,目前常用的质量分数检测方法主要有高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)[8]和液相色谱-质谱联用技术(Iiquidchromatograph mass spectrometer,LC-MS)[9]等。由于甲磺酸伊马替尼的结构特性,应用这些方法进行质量分数测定时均需要被测样品的对照品,在配制流动相的过程中往往会添加三乙胺或者离子对试剂如辛烷磺酸钠等,但在质量分数测定实验中流动相平衡时间过长,且重现性差[10],在离子对试剂的使用过程中,对色谱柱有一定的损害,使色谱柱使用寿命和柱效降低[11]。

近年来,定量核磁共振技术(Quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)逐渐被用于药物质量分数测定中,原理是不同环境下响应信号的积分强度与化合物中被激发质子数成正比[12]。利用qNMR方法,既能够对化合物结构进行鉴定归属,又可以利用分子结构中特定基团的质子数与其相应谱峰的峰面积之间的正比关系进行质量分数测定,方法简单快捷,特异性强,不破坏样品,可使用已知质量分数的普通化学物质作为内标,而不必使用待测物的对照品,适合无对照品的新化合物的定量测定[13-17]。NMR定量常见方法分为相对定量法和绝对定量法,其中绝对定量法适用于无对照品的新药质量分数测定[18]。qNMR技术已经被广泛应用于医学[19]、药学[20-21]、生物学[22]和食品[23]等诸多学科领域。笔者在前期研究工作的基础上[24-26],对甲磺酸伊马替尼的1D,2D NMR数据进行归属,建立了甲磺酸伊马替尼质量分数测定的qNMR方法。到目前为止,尚未见到有关采用qNMR方法对甲磺酸伊马替尼进行质量分数测定的报道。

1 实 验

1.1 原料与试剂

甲磺酸伊马替尼原料药,江苏八巨药业有限公司提供(批号:201704008);甲磺酸伊马替尼对照品,上海源叶生物科技有限公司(批号:G28O6K5134,质量分数99.9%);顺丁烯二酸对照品,中国食品药品检定研究院(马来酸,批号:VLD6-3BQZ,质量分数99.7%);氘代二甲基亚砜,美国Sigma公司(DMSO-d6,99.9% D);乙酸铵,天津市永大化学试剂有限公司(分析纯,批号:2014G705,质量分数98%);乙腈,美国TEDIA公司(色谱纯,批号:20095293,质量分数99.9%)。

1.2 仪器与条件

所有NMR实验均在600 M AVANCE Ⅲ核磁共振仪上进行,NMR谱图处理均在Bruker Topspin 3.5.6软件上完成,对每幅图进行相位调整和基线校正。采集条件是zg 90脉冲序列,温度为298 K,谱宽(SWH)为12 019 Hz,采样点数(TD)为30 s,扫描次数(NS)为32次。甲磺酸伊马替尼的质量分数测定采用计算公式为

(1)

式中:Ix为样品定量峰积分面积;Nx为样品定量峰代表的氢个数;Mx为样品分子量;Wx为样品称样质量;Istd为内标峰积分面积;Nstd为内标峰代表的氢个数;Mstd为内标分子量;Wstd为内标称样质量;Pstd为内标质量分数。

所有HPLC实验均在Agilent 1260上完成。采集条件是Welch Welchrom-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),测定波长254 nm,流动相V(乙腈)∶V(1%醋酸铵水溶液)=60∶40,柱温30 ℃,流速0.7 mL/min。

1.3 溶液配制

1.3.1 NMR内标溶液和供试品溶液制备

精密称取马来酸对照品11 mg,置于2 mL容量瓶中,加入约2 mL DMSO-d6溶解后定容至刻度线,得内标溶液。

精密称取甲磺酸伊马替尼原料药25.35 mg,置于2 mL容量瓶中,加入约2 mL DMSO-d6溶解后定容至刻度线,得供试品溶液。

1.3.2 HPLC标准曲线溶液配制

精密称取5.3 mg的甲磺酸伊马替尼对照品,置于10 mL容量瓶中,加入V(乙腈)∶V(水)=60∶40的溶剂溶解后定容至刻度线,再分别稀释成0.02,0.05,0.1,0.2,0.4 mg/mL的系列标准溶液。

2 结果与讨论

2.1 甲磺酸伊马替尼的结构归属

甲磺酸伊马替尼的化学名为4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]-苯胺甲磺酸盐。甲磺酸伊马替尼的结构式为

甲磺酸伊马替尼1D NMR谱图如图1所示。由图1(a,b)可知:除溶剂峰(DMSO-d6)外共有34个氢质子和23组碳信号,其中碳信号结合图1(c),可知共有12组伯碳或叔碳,3组仲碳,其余为季碳,部分碳原子由于化学结构特性,其化学位移重叠在一起。

图1 甲磺酸伊马替尼1D NMR谱图Fig.1 1D NMR spectrum of imatinib mesylate

甲磺酸伊马替尼2D NMR谱图如图2所示。根据化学结构与位移可以将δ2.22处的质子归属于H-24,结合图2(b)中直接相连的碳氢关系,将δ17.56处的碳归属为C-24。根据图2(c)中远程偶合的碳氢关系,该处质子与δ133.98处的碳信号相关联,可推出δ133.98为C-21。在图2(b)中,C-21与δ7.20～7.21处质子有相关点,将δ7.20～7.21处的质子归属于H-22和H-22,对应的碳化学位移为δ129.96,碳信号归属于C-22;在图2(a)中,同一碳上的氢质子有耦合关系,H-22与δ7.48～7.49处的质子有相关点,将该处的质子归属于H-23,对应的碳化学位移为δ116.75,碳信号归属于C-23。根据结构,C-18是季碳,结合图2(c)和图1(c),可推出C-18化学位移为δ137.06;在图2(c)中,C-18与δ8.07～8.08处的质子有相关点,推出该处的质子为H-19,由图2(b)可以推出碳信号化学位移δ117.24为C-19;在图2(c)中,H-19与δ137.74处有相关点,又根据图1(c)显示该处碳信号为季碳,可以推出碳信号为C-20。

图2 甲磺酸伊马替尼2D NMR谱图Fig.2 2D NMR spectrum of imatinib mesylate

化合物结构中共有3组仲碳,根据结构可以判断此处仲碳对应的质子峰信号在高场,且峰型为单峰,将δ3.64处的氢归属为H-8,根据图2(b),将δ60.34处的碳归属为C-8;在图2(c)中,H-8与δ40.84处的碳有相关点,结合图1(c),可以推出δ140.84处的碳信号为C-9,在图2(c)中,C-9和δ7.94～7.95处的质子有相关点,将δ7.94～7.95处的质子归属于H-11和H-13;在图2(b)中,将δ127.63处的碳信号归属为C-11和C-13;在图2(a)中,δ7.94～7.95与δ7.45～7.46处的质子有相关点,将δ7.45～7.46处的质子归属为H-10和H-14;在图2(b)中,将δ128.71处的碳信号归属于C-10和C-14;在图2(c)中,H-11和H-13与δ134.35处有相关点,将δ134.35归属为C-12;在图2(c)中,H-8与δ49.18处有相关点,将δ49.18处的碳信号归属为C-2和C-6,此处碳信号为仲碳,可以推出δ2.33和δ2.91处的质子分别为H-2a,H-6a和H-2b,H-6b;在图2(a)中,此2处质子同时与δ2.89和δ3.04处的质子相关,推出该2处质子分别为H-3a,H-5a和H-3b,H-5b,根据图2(b),将δ52.71处碳信号归属为C-3,C-5。

由于羰基在碳谱中的位移处于低场,故将δ164.99处碳信号归属为C-15。在图2(c)中,C-15与δ10.15处的质子有相关点,将该质子归属为H-16;在图2(c)中,C-20与δ8.95处的质子有相关点,将该质子归属为H-25;在图2(c)中,H-25与δ161.54有相关点,结合图1(c),该处碳信号为季碳,将该碳信号归属为C-26;在图2(c)中,C-26与δ8.50～8.51处的质子有相关点,将该质子归属于H-30,根据图2(b),将δ159.41处碳信号归属于C-30;在图2(a)中,H-30与δ7.42～7.43处的质子有相关点,将该处质子归属于H-29,根据图2(b),将δ107.46归属为C-29;在图2(c)中,H-29与δ161.14处的碳信号有相关点,且该处为季碳,将δ161.14归属为C-28;在图2(c)中,C-28与δ9.27～9.23和δ8.46～8.48处的质子有相关点,根据结构以及峰形,将δ9.27～9.23归属为H-37,δ8.46～8.48归属为H-33;在图2(b)中,将δ132.16归属为C-33,δ148.13归属为C-37;在图2(c)中,C-33与δ7.50～7.52处有相关点,将该处质子归属于H-34,在图2(b)中,δ123.70归属为C-34;在图2(c)中,C-34与δ8.67～8.68有相关点,将该处质子归属为H-35,在图2(b)中,将δ151.29归属为C-35;由于受到氮原子的电负性影响,与氮相连的甲基应在较低场,故将δ2.79归属为H-7,δ2.31归属为H-4′;在图2(b)中,将δ39.91归属为C-4′,δ42.16归属为C-7。

甲磺酸伊马替尼的1D及2D的NMR结构解析数据归纳整理如表1所示。

表1 甲磺酸伊马替尼的NMR数据Table 1 NMR data of Imatinib Mesylate

2.2 专属性实验

马来酸是常用的定量核磁共振法内标物,内标物马来酸既不干扰待测物峰信号,又在DMSO-d6中有较好的溶解度,因此马来酸可作为内标物进行定量。根据样品和内标的溶解性,选择DMSO-d6作为溶剂,由于高场区质子信号密集,因此选择低场区的质子信号作为定量峰,待测物甲磺酸伊马替尼低场区质子信号分别选择为δ7.21～7.22,δ7.43～7.44,δ7.54～7.56,δ8.103～8.106作为定量峰,并且与溶剂峰δ2.50、内标物马来酸定量峰δ6.26互不干扰。甲磺酸伊马替尼与马来酸(MA)的1HNMR谱图(DMSO-d6)如图3所示。

图3 内标组、样品含内标组、样品组的1H NMR谱图Fig.3 1H NMR spectrum of IS, sample with IS, and samples

2.3 线性关系考察

采用1.3.1节的试品溶液与内标溶液,2种溶液按V(供)∶V(内)分别为2∶5,3∶4,1∶1,4∶3,5∶2混合后至0.7 mL摇匀,分别精密量取混合溶液0.6 mL加至核磁共振样品管中测试,以横坐标X为m(甲磺酸伊马替尼)∶m(马来酸),纵坐标Y为定量峰面积,得到回归方程为Y=0.097 6X-0.005,相关系数r=0.999,m(甲磺酸伊马替尼)∶m(马来酸)为0.92～5.77时与定量峰面积比呈良好线性。

2.4 仪器精密度实验

精密称取甲磺酸伊马替尼5.97 mg,马来酸对照品5.82 mg,溶解于0.6 mL DMSO-d6中,振荡,转移至5 mm核磁管中,按1.2节的条件连续测定5次,甲磺酸伊马替尼和马来酸定量峰峰面积比的RSD为0.93%。结果显示该方法精密度良好,其结果如表2所示。

表2 仪器精密度实验结果Table 2 Precision test results of instrument

2.5 重复性实验

精密称取甲磺酸伊马替尼样品6 mg,马来酸对照品5 mg用0.6 mL DMSO-d6溶解,混匀。平均配制6份。按1.2节的条件测定,算出甲磺酸伊马替尼定量峰面积与称样量比值的RSD为1.6%,甲磺酸伊马替尼质量分数为98.6%。结果显示该方法重复性良好,其结果如表3所示。

表3 重复性实验结果Table 3 Repeatability test results

2.6 稳定性实验

取2.4节的样品,室温放置时间分别为0,4,8,12,18,24 h,测定其定量峰面积与内标物定量峰面积比的RSD为1.08%,表明样品溶液在室温下24 h内稳定。结果显示该方法稳定性良好,其结果如表4所示。

表4 稳定性实验结果Table 4 Stability test results

2.7 HPLC法与qNMR法测定结果对比

对于甲磺酸伊马替尼原料药的质量分数测定,参考了《印度药典》2010年版中对甲磺酸伊马替尼的规定,甲磺酸伊马替尼对照品在质量浓度为0.4～0.02 mg/mL时与峰面积X线性关系良好,线性回归方程为Y=89 602X-129.44,相关系数r=0.999 9,平行配制3份样品溶液,取峰面积平均值,得出甲磺酸伊马替尼原料药质量分数为98.2%。HPLC质量分数测定结果与qNMR方法对比测得的质量分数结果98.6%基本一致。

3 结 论

实验建立了qNMR方法测定甲磺酸伊马替尼原料药质量分数。定量峰的选择主要依据以下规则:1) 定量峰与其相邻峰的分离度好,易于识别;2) 定量峰对应氢质子的化学结构尽量与内标物结构相似,化学位移相近,减小误差;3) 定量峰对应的氢质子为非活泼氢。在甲磺酸伊马替尼的氢谱中,4处的共振峰δ在7.21～7.22,7.43～7.44,7.54～7.56,8.103～8.106均为芳环上SP2杂化碳上的氢,各之间均具有良好的分离度,同时内标马来酸中的定量峰也为SP2杂化碳上的氢,化合物环境相似。因此,实验中选择4处化学位移的共振峰作为定量峰。在定量核磁实验中不需要引入任何校正因子及特定的对照品,所需的样品量少,对待测物无破坏性,而且检测时间快,通过与HPLC定量法结果进行对比,显示质量分数结果准确。在采用HPLC测定有机酸盐时,不仅流动相的配制操作繁琐,而且对色谱柱的使用及寿命造成影响,不适合测定有机盐的质量分数。在采用qNMR方法对化合物定量的同时,还可以通过1D,2D NMR谱图归属出化合物分子结构,满足对甲磺酸伊马替尼进行质量控制的要求。