刺山柑治疗系统性硬化症机制的网络药理学探究及分子对接验证

郭 嘉，卞 华，单 雨，赵晶晶，张潇文，陈 爽，卞 博

（1. 河南中医药大学，河南 郑州 450046；2. 南阳理工学院张仲景国医国药学院，河南 省张仲景方药与免疫调节重点实验室，河南南阳 473004）

系统性硬化症（systemic sclerosis，SSC）是一种免疫介导的疾病，其发病机制是血管病变、免疫系统激活和广泛的组织纤维化的复杂相互作用［1］。尽管有证据表明其存活率有所提高，但死亡率仍然很高，比任何其他风湿性疾病都高［2，3］。目前临床常用免疫抑制剂与激素控制病情。免疫抑制剂包括环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤，以及最近使用的单克隆抗体进行的靶向治疗［4］。尽管研究显示治疗后皮肤和肺部受累有所改善，但尚无确切证据表明它们能有效治疗硬皮病［5，6］。

刺山柑是维吾尔族用于治疗风湿病的一味常用药，使用范围包括根皮、叶和果实，具有祛风、散寒、除湿的作用［7］。近年来多项基础研究表明刺山柑在SSC 小鼠模型中可通过调节多项通路和细胞因子来影响SSC 的疾病进展［8-11］。本研究使用网络药理学方法，利用已有数据库，对刺山柑治疗SSC过程中可能作用的靶点和通路进行预测，为今后相关临床研究提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 SSC 靶点的收集

登录GEO 数据库获取GSE76807 芯片，P＜0.05，｜logFC｜＞0.5 为过滤条件，使用R 软件绘制火山图，筛选差异基因。分别登录GeneCards、PharmGkb、TTD 以及DrugBank 以“scleroderma”为关键词搜索SSC 相关靶点。

1.2 刺山柑治疗SSC 靶点预测

查阅相关文献［7，12，13］获取刺山柑化学成分，依次输入PubChem 数据库获取2D 结构，导入SwissTargetPrediction 数据库获取刺山柑靶点。汇总后删除重复数据。将刺山柑靶点与SSC 靶点取交集，并绘制Venn 图，获取有效靶点。使用Cytoscape 3.8.0 绘制刺山柑-成分-靶点网络图。

1.3 PPI 网络构建及拓扑分析获取核心基因

登录String 数据库，导入有效靶点，选择人类物种，设置最低得分0.4，获取蛋白互作分析（PPI）网络图并保存CSV 文件。打开Cytoscape 3.8.0 导入CSV 文件，使用自带CytoNCA 插件进行拓扑分析，过滤条件为中介中心度（betweenness centrality，BC）、接近中心度（closeness centrality）、程度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心度（Eigenvector centrality，EC）、基于局部平均连接度的方法（local average connectivity-based method，LAC）、信息中心度（information centrality）以及网络中心性（network centrality）每次大于中位值，最终获取核心基因。

1.4 分子对接验证

将获取的核心基因登录PDB 数据库下载其结构，去除水分子和小分子配体，与其所对应的化合物使用AutoDock Vina 软件进行分子对接。选取最低结合能的组合结果，使用Pymol 软件进行可视化绘图。

1.5 GO 和KEGG 分析

通过R 软件中的ClusterProfiler 对预测基因进行基因本体论（gene ontology，GO）的生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）和京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，对P值进行FDR（false discovery rate）矫正，设置阈值qvalue＜0.05，使用R 软件进行绘图。

2 结果

2.1 SSC 相关靶点

GSE76807 芯片过滤作火山图（图1），获取差异基因1 431 个。分别于GeneCards、PharmGkb、TTD以及DrugBank 数据库获取SSC 相关靶点1 796 个、74 个、8 个和1 个。去除重复基因，共获取SSC 相关靶点3 171 个。

图1 GSE76807 芯片基因差异火山图Fig 1 Gene difference volcano map of GSE76807 chip

2.2 刺山柑治疗SSC 靶点预测

去除无有效靶点的成分和重复基因后，获取刺山柑有效成分黄酮类［汉黄芩素（Wogonin）、异鼠李素（Isorhamnetin）、山柰酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）、异银杏黄素（Isoginkgetin）、银杏黄素（Ginkgetin）、樱黄素（Prunetin）、Isorhamnetin-3-Orutinoside、槲皮素3-O-glucoside-7-O-rhamnoside、槲皮素3-O-glucoside、山奈酚-3-glucoside、芦丁（Rutin）］、生物碱类［Cadabicine、烟酰胺（Niacinamide）以及水苏碱（Stachydrine）］共15 个，所对应靶点178个。将SSC 靶点与刺山柑靶点取交集获得预测靶点66 个，并在Cytoscape 3.8.0 软件中绘图（图2），其中图中节点大小与其在网络中边的数量成正相关。

图2 刺山柑-有效成分-靶点网络图Fig 2 Capparis spinosa-active ingredients-target network diagram

2.3 PPI 网络构建及拓扑分析获取核心基因

登录String 数据库，将预测靶点输入，物种选择人类，过滤得分为0.4，绘制PPI 网络图（图3）。保存TSV 文件，导入Cytoscape 3.8.0 软件进行拓扑分析（图4），最终获取核心基因VEGFA、TNF、AKT1、PTGS2、MMP9、MMP2、ACE、IL2、EGFR以及ESR1。

图3 PPI 网络图Fig 3 PPI network diagram

图4 Cytoscape 拓扑分析Fig 4 Cytoscape topology analysis

2.4 分子对接验证

选取核心基因排名靠前的VEGFA、TNF、AKT1、PTGS2、MMP9 靶蛋白与度值排名前6 的化合物（汉黄芩素、异鼠李素、山柰酚、槲皮素、异银杏黄素、银杏黄素）进行分子对接，选取最低结合能组合（表1）使用Pymol 软件进行绘图（图5～9）。最低结合能越低，靶蛋白与活性成分之间结合活性度越高，说明两者之间结合能力越好。结果表明靶蛋白与刺山柑主要有效成分具有较强的结合能力。

图5 AKT1-异银杏黄素Fig 5 AKT1- Isoginkgetin

图6 MMP9-槲皮素Fig 6 MMP9-Quercetin

图7 PTGS2-银杏黄素Fig 7 PTGS2- Ginkgetin

图8 TNF-异银杏黄素Fig 8 TNF-Iso- Isoginkgetin

图9 VEGFA-异银杏黄素Fig 9 VEGFA- Isoginkgetin

表1 核心靶点与有效成分分子对接结果Tab 1 Molecular docking results between core targets and active ingredients

2.5 GO 和KEGG 通路分析

GO 分析（图10）显示涉及的BP 过程有活性氧代谢过程（reactive oxygen species metabolic process）、蛋白激酶B 信号（protein kinase B signaling）、炎症反应的调节（regulation of inflammatory re-sponse）、磷脂酰肌醇3-激酶信号（phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、细胞对药物的反应（cellular response to drug）。CC 过程涉及多巴胺能神经突触（dopaminergic synapse）、突触膜的组成部分（integral component of synaptic membrane）、突触膜的内在组成部分（intrinsic component of synaptic membrane）、谷氨酸能突触（glutamatergic synapse）、突触后膜的组成部分（integral component of postsynaptic membrane）等。MF 过程涉及血红素结合（heme binding）、四吡咯结合（tetrapyrrole binding）、儿茶酚胺结合（catecholamine binding）、核受体活性（nuclear receptor activity）、配体激活的转录因子活性（ligand-activated transcription factor activity）、转录辅激活结合（transcription coactivator binding）、G 蛋白偶联胺受体活性（G protein-coupled amine receptor activity）、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、金属肽酶活动（metallopeptidase activity）等。KEGG 通路分析（图11）显示涉及PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、蛋白聚糖与癌症（Proteoglycans in cancer）、人乳头瘤病毒感染（Human papillomavirus infection）、黏着斑（Focal adhesion）、Rap1 信号通路（Rap1 signaling pathway）、MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）、癌症中的microRNA（MicroRNAs in cancer）等通路。

图10 GO 富集分析Fig 10 GO enrichment analysis

图11 KEGG 富集分析Fig 11 KEGG enrichment analysis

3 讨论

现代药理学研究发现刺山柑含有广泛的生物活性化合物，如生物碱、黄酮类、甾体类、萜类和生育酚［14］，其分离鉴定主要集中在果实中。本研究发现，刺山柑治疗SSC 的主要化学成分为汉黄芩素、异鼠李素、山柰酚、槲皮素等。汉黄芩素对肝纤维化具有保护作用。汉黄芩素能显著减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化和TGF-β1激活的肝星状细胞的肝纤维化［15］。汉黄芩素能有效地抑制TGF-β1诱导的I型胶原和α-平滑肌肌动蛋白表达水平的上调，并且可以降低Smad3 磷酸化，从而起到在肾小管上皮细胞中抗纤维化作用［16］。异鼠鼠素通过抑制TGF-β1介导的Smad3 和p38 MAPK 信号通路，从而减少细胞外基质的形成和自噬，对肝纤维化具有保护作用［17］。山奈酚注射可显著减少受损皮肤的瘤状细胞SMA+肌成纤维细胞、CD3+T 细胞和CD68+巨噬细胞的数量［18］。此外，山奈酚可显著降低硬化皮肤中氧化应激相关因子HO-1、NOX2 的mRNA 水平，以及炎性和促纤维化细胞因子IL-6、TGF 和TNF 的mRNA 水平。山奈酚可以抑制氧化诱导的SSC 成纤维细胞内活性氧（ROS）的积累，降低氧化诱导的SSC 成纤维细胞的凋亡［18］。槲皮素可以抑制F4/80+/CD11b+/CD206+ M2 巨噬细胞的极化，并通过拮抗TGF-β1/Smad2/3 信号，减少细胞外基质的过度积累和间质纤维化，来改善肾纤维化［19］。

SSC 内皮功能障碍是其最重要的特征，它涉及到大血管和微血管。微循环进行性紊乱导致慢性组织缺氧状态，刺激血管生成生长因子如血管内皮生长因子（VEGF）的释放，与健康人群对比SSC 患者的血清VEGF 水平更高［20］。有基础研究表明刺山柑总生物碱对SSC 的VEGF 与ET-1 异常表达具有一定调节作用［21］。IL-22 能使成纤维细胞对TNF产生反应，并通过促进TNF 诱导的角化细胞激活促进促炎成纤维细胞表型。这些结果证实了角化细胞-成纤维细胞相互作用在皮肤纤维化中的影响［22］。PTGS2 又称环氧合酶-2（COX-2），其在内皮功能中的作用包括血管反应性和血管生成［23］。有研究表明COX-2 升高的患者中，除了TNF-α 水平升高外，趾部溃疡和关节炎的发病率也很高［24］。SSC 的主要病理特征是皮肤和内部器官纤维化，这是由正常的组织结构改变和细胞外基质（ECM）蛋白沉积造成的。ECM 组分被基质金属蛋白酶（MMP）降解［25］。国内有研究表明刺山柑总生物碱可通过调节MMP-9/TIMP-1 失衡，减少Col-Ⅳ合成，改善SSC 组织纤维化。

通路分析显示刺山柑治疗SSC 可能涉及多条通路。现已有研究表明PI3K-Akt 信号通路与皮肤纤维化评分具有密切的相关性和时间模式。COMP、THBS1、THBS4、FN1和TNC是PI3K-Akt通路在皮肤纤维形成中的前沿基因［26］。有试验证明BBEZ235 阻断PI3K/Akt/mTOR 信号通路对真皮纤维化有较好地抑制作用，这提示垂直抑制PI3K/Akt/mTOR 信号传导通路可能对SSC 有治疗潜力［27］。病毒感染被认为是SSC 发生的一个共同因素［28］，虽然HPV 的作用到目前为止还没有被评估，但一项SSC 妇女人乳头状瘤病毒感染的筛查显示在SSC 组中多重HPV 感染的频率是对照组的两倍［29］。蛋白多糖可以通过其核心蛋白和糖胺聚糖与细胞外基质蛋白、生长因子和趋化因子的多种相互作用，影响细胞信号转导、运动、黏附、生长和凋亡［30］。肿瘤发生过程中的细胞变化和酶活性可以改变蛋白多糖的组成和结构，从而改变其功能，这可能与SSC 发病有相关性。关于黏着斑通路，一项研究表明增强的黏附信号与SSC 成纤维细胞的纤维化表型密切相关，阻断黏附信号或ROS 的产生可能有利于控制SSC 中观察到的纤维化［31］。Rap1 信号通路与血管发育和内皮细胞生物学的多个方面相关［32］，这与SSC 皮肤内皮细胞变性有着密切联系。哺乳动物MAPK 家族的三大类包括ERKs、c-jun 氨端或应激激活蛋白激酶（JNK/SAPKs）和p38 激酶［33］，p38MAPK 信号通路在TGF-β 介导的人α2（I）胶原基因在正常皮肤成纤维细胞中的调节以及在SSC 成纤维细胞中I 型胶原和纤维连接蛋白的结构性上调中起重要作用［34］。Bagnato 等［35］认为miRNAs 在生物学上比仅是mRNA 稳定性的内源性调节器更复杂，而且也可能像细胞因子一样提供炎症信号，进一步将miRNAs 的作用扩展到参与纤维化疾病发病机制的免疫过程的直接调节器。

综上所述，刺山柑治疗SSC 可能是通过汉黄芩素、异鼠李素、山柰酚、槲皮素等多种化合物，作用于VEGFA、IL-22、TNF、PTGS2、MMP2、MMP9等蛋白靶点和PI3K-Akt 信号通路、蛋白聚糖与癌症、粘着斑、Rap1 信号通路、MAPK 信号通路、癌症中的microRNA 等通路产生效用。本研究为后续研究刺山柑治疗SSC 提供了理论依据和数据支撑，但由于调用数据库有限等客观原因，可能存在误差，课题组将会在未来继续跟进此项研究。