ESD联合和胃愈疡方对早期胃癌大鼠的治疗效果及安全性评价

于涛　姚金东　于鑫

【摘要】 目的：分析內镜黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection，ESD）联合和胃愈疡方对早期胃癌大鼠的治疗效果及安全性评价。方法：采用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidine，MNNG）与乙醇混合液诱导大鼠胃癌模型的建立。根据处理方法不同，将40只造模成功大鼠随机分成模型组、外科组、内镜黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection，ESD）组及联合治疗组（ESD+和胃愈疡方），每组10只。另选取10只大鼠作为对照组。比较外科组与ESD组术中出血量;干预过程中对大鼠体重、行为学进行观察;干预12周后，对各组炎症因子、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、前列腺素E₂（prostaglandin E₂，PGE₂）、CD4和CD8的表达水平，胃组织溃疡指数、溃疡抑制率及再生黏膜厚度进行检测与比较。结果：与外科组相比，ESD组术中出血量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。干预12周后，与对照组相比，模型组大鼠体重、CD4、EGF、PGE₂、CD4/CD8及再生黏膜厚度明显降低，TNF-α、IL-8、CEA、CD8及溃疡指数均明显上升（P<0.05）;与模型组相比，外科组、ESD组、联合治疗组大鼠体重、CD4的表达量、CD4/CD8、EGF、PGE₂、溃疡抑制率及再生黏膜厚度均明显升高，TNF-α、IL-8、CEA、CD8及溃疡指数均明显降低（P<0.05）;与ESD组相比，联合治疗组大鼠体重、CD4、CD4/CD8、EGF、PGE₂、溃疡抑制率及再生黏膜厚度明显升高，TNF-α、IL-8、CEA、CD8及溃疡指数明显降低（P<0.05）。

结论：ESD联合和胃愈疡方对早期胃癌大鼠具有较好的治疗效果，安全性较好。

【关键词】 内镜黏膜下剥离术 和胃愈疡方 N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍 癌胚抗原 表皮生长因子 前列腺素E₂

Therapeutic Effect and Safety Evaluation of ESD Combined with Hewei Yuyang Formula on Early Gastric Cancer Rats/YU Tao， YAO Jindong， YU Xin. //Medical Innovation of China， 2022， 19（07）： 0-027

[Abstract] Objective： To analyze therapeutic effect and safety evaluation of endoscopic submucosal dissection （ESD） combined with Hewei Yuyang Formula on early gastric cancer rats. Method： The gastric cancer model was established by using the mixture of N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine （MNNG） and ethanol. According to different treatment methods， 40 successfully modeled rats were randomly divided into model group， surgical group， endoscopic submucosal dissection （ESD） group and combined treatment group （ESD+Hewei Yuyang Formula）， with 10 rats in each group. Another 10 rats were selected as the control group. The amount of intraoperative blood loss was compared between the surgical group and the ESD group. The weight and behavior of rats were observed during the intervention. After 12 weeks of intervention， the expression levels of inflammatory factors， carcinoembryonic antigen （CEA）， epidermal growth factor （EGF）， prostaglandin E₂（PGE₂）， CD4 and CD8， gastric ulcer index， ulcer inhibition rate and thickness of regenerated mucosa in each group were detected and compared. Result： Compared with the surgical group， the amount of intraoperative blood loss in ESD group was significantly decreased， the difference was statistically significant （P<0.05）. After 12 weeks of intervention， compared with the control group， body weight， CD4， EGF， PGE₂， CD4/CD8 and regenerated mucosal thickness of model group were significantly decreased， while TNF-α， IL-8， CEA， CD8 and ulcer index were significantly increased （P<0.05）. Compared with model group， body weight， CD4 expression level， CD4/CD8， EGF， PGE₂， ulcer inhibition rate and regenerated mucosa thickness were significantly increased in surgery group， ESD group and combined treatment group， while TNF-α， IL-8， CEA， CD8 and ulcer index were significantly decreased （P<0.05）. Compared with ESD group， body weight， CD4， CD4/CD8， EGF， PGE₂， ulcer inhibition rate and regenerated mucosa thickness were significantly increased in combined treatment group， while TNF-α， IL-8， CEA， CD8 and ulcer index were significantly decreased （P<0.05）. Conclusion： ESD combined with Hewei Yuyang Formula has good therapeutic effect and safety on rats with early gastric cancer.gzslib202204021630F3827AEF-7A78-4CCB-A9B5-A0801805496E

[Key words] Endoscopic submucosal dissection Hewei Yuyang Formula N-methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidine Carcinoembryonic antigen Epidermal growth factor Prostaglandin E₂

First-authors address： Panjin Hospital of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Province， Panjin 124000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.07.006

胃癌是常见的消化道肿瘤之一，其发病率和病死率在恶性肿瘤中均高居第二位，严重影响人民的生命健康和生活质量[1]。早期胃癌（early gastric cancer，EGC）指癌组织限于胃黏膜层及黏膜下层，患者可无任何症状，而待出现明显临床症状时，大多已是中晚期[2]。目前我国早期胃癌的发现率约10%，早期胃癌治愈率可达90%，因此早诊断、早治疗对提高胃癌治疗效果，降低病死率是非常重要的[3]。内镜黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection，ESD）是近年来出现的一项新的微创技术，与传统手术及经内镜黏膜切除术（EMR）相比具有创伤小、并发症少、复发概率低、恢复快等优点，主要应用于治疗癌前病变和早癌患者[4]。但由于ESD操作难度大、操作时间较长，切除的病灶较深，术后往往形成深大的医源性溃疡，面积大，愈合时间长，影响患者术后恢复[5]。研究表明，胃癌的发生和发展与体内炎症因子、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、前列腺素E₂（prostaglandin E₂，PGE₂）、CD4和CD8的表达水平密切相关。胃ESD术后溃疡的病机为脾气不健、失于升清、火毒内炽、胃失和降等，病位在脾、胃，应泻火解毒、和胃愈疡，文献[6]结果显示和胃愈疡方对胃ESD术后溃疡的修复有显著促进效果，因此本研究建立早期胃癌大鼠模型，就ESD联合和胃愈疡方对早期胃癌大鼠的治疗效果及安全性评价进行分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍购自上海一研生物科技有限公司;大鼠TNF-α、IL-8 ELISA试剂盒购自上海琛艺实业有限公司;大鼠CEA ELISA试剂盒购自上海磅景实业有限公司;大鼠EGF、PGE₂ELISA试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司;Rat anti-Mouse CD4 Monoclonal Antibody， FITC及Rat anti-Mouse CD8 Monoclonal Antibody， PE购自上海通善生物科技有限公司;流式细胞仪、Varioskan LUX 多功能酶标仪酶标仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;和胃愈疡方组成：川黄连3 g、吴茱萸1 g、茯苓20 g、乌贼骨30 g、浙贝母10 g、四叶参10 g、白及20 g、延胡索20 g、白芷10 g。每剂煎煮成120 mL药液，放入4 ℃冰箱保存。

1.1.2 实验动物 SPF级Wistar大鼠56只（雌︰雄=1︰1），体重160～180 g，购自陕西省医学实验动物中心。温度22～25 ℃，相对湿度为40%～60%，每天光照12 h。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及实验动物分组 取46只大鼠采用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidine，MNNG）诱导大鼠胃癌模型的建立[7-8]。从喂养第1周起给予100 μg/mL MNNG的5%酒精-水溶液作为常规饮用水。含MNNG的饮用水需现配现用，避光保存。饲养8周后，用上述饮用水配制粉状饲料来替代块状饲料。饲养24周后仍改为块状饲料喂养，但MNNG水改为隔天给予。饲养28周停止给予MNNG饮用水，改用自来水喂养。将造模成功的40只胃癌大鼠随机分成模型组、外科组、ESD组、联合治疗组（ESD+胃愈疡方），每组10只;另取10只大鼠作为对照组。对照组在整个实验过程中给予自来水及不含MNNG的饲料饲养。

1.2.2 模型鉴定 饲养32周后，在造模的46只大鼠中随机选取6只大鼠断尾处死后，暴露并游离胃，沿胃大弯切开，分别取材胃底、胃体、小弯、幽门及十二指肠于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片、染色，并于顯微镜下观察组织形态，确定造模情况。

1.2.3 干预方法 对照组和模型组大鼠每天灌胃1.25 mL/100 g生理盐水;外科组采用10%水合氯醛将大鼠麻醉后进行常规外科手术切除病灶部分，每天灌胃1.25 mL/100 g生理盐水;ESD组采用10%水合氯醛将大鼠麻醉后进行ESD切除病灶部分，每天灌胃1.25 mL/100 g生理盐水;联合治疗组采用ESD切除病灶部分，每天灌胃1.25 mL/100 g和胃愈疡方煎剂。

1.3 观察指标及判定方法 （1）外科组和ESD组术中出血量比较。（2）体重、行为学观察。观察大鼠的行为学变化，包括活动度、精神状态、皮毛颜色光泽、粪便性状等和死亡情况。（3）炎症因子表达。治疗12周后，用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，颈动脉插管采血，静置2 h后，4 000 r/min离心15 min，分离血清于-20 ℃冰箱保存，用ELISA方法对大鼠血清中TNF-α和IL-8的表达水平进行检测，具体步骤参考试剂盒说明书。（4）癌胚抗原（CEA）表达。取上清用ELISA方法对大鼠血清中CEA的表达水平进行检测，具体步骤参考试剂盒说明书。（5）EGF、PGE₂表达。取上清用ELISA方法对大鼠血清中EGF、PGE₂的表达水平进行检测，具体步骤参考试剂盒说明书。（6）CD4、CD8水平检测。取大鼠全血按3.3︰1加入肝素钠溶液中混匀，将抗凝血加入标记好的流式管内，用FITC Rat Anti-Mouse CD4和PE Rat Anti-Mouse CD8分别处理后，采用流式细胞仪对大鼠血浆中CD4、CD8水平进行检测。（7）溃疡指数和溃疡抑制率。治疗12周后，暴露并游离胃，结扎贲门和幽门后取胃，于胃腔内注入10%的多聚甲醛溶液后，将整个胃组织放入10%的多聚甲醛溶液中固定后，冲洗后沿胃大弯剪开铺平，观察溃疡并参照Guth标准测定溃疡指数，计算溃疡抑制率=（模型组溃疡指数-各治疗组溃疡指数）/模型组溃疡指数[9]。（8）再生黏膜厚度。将固定好的胃展平，剪下溃疡组织，脱水后分别放入50%乙醇二甲苯、二甲苯中浸泡2 h，制备石蜡切片，经HE染色后，于显微镜下测量再生黏膜厚度、细胞核、腺体、间质等改变。gzslib202204021630

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用χ²检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外科组与ESD组出血量比较 ESD组术中出现量为（0.96±0.14）g，低于外科组的（2.19±0.31）g，差异有统计学意义（t=11.477，P<0.05）。

2.2 五组体重、行为学观察 对照组大鼠皮毛光泽，精神较好，灵活喜动，饮食正常;模型组大鼠皮毛凌乱且光泽度较差，精神萎靡不振，懒动，大便溏薄;均有不同程度皮毛欠光泽，精神欠佳、活动度及饮食减少等。各组大鼠初始体重比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;干预前，与对照组相比，其他各组大鼠体重均降低，差异均有统计学意义（P<0.05）;干预12周后，与模型组相比，其他各组大鼠体重均大于模型组，差异均有统计学意义P<0.05）。见表1。

2.3 五组炎症因子表达情况 与对照组相比，模型组TNF-α和IL-8均明显上升（P<0.05）。与模型组相比，外科组、ESD组、联合治疗组TNF-α和IL-8均明显降低（P<0.05）。ESD组TNF-α和IL-8均低于外科组，联合治疗组TNF-α和IL-8均低于ESD组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 五组CEA表达情况 模型组CEA为（382.02±19.87）ng/L，高于对照组的（221.30±24.01）ng/L，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组CEA相比，外科组（291.50±22.18）ng/L、ESD组（277.36±21.24）ng/L、联合治疗组（252.73±13.23）ng/L均明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与外科组、ESD组相比，联合治疗组CEA明顯降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.5 五组EGF、PGE₂表达情况比较 与对照组相比，模型组EGF、PGE₂均明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，外科组、ESD组、联合治疗组EGF、PGE₂均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与ESD组相比，联合治疗组大鼠EGF、PGE₂均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.6 五组CD4、CD8水平比较 与对照组相比，模型组CD4及CD4/CD8均明显降低，CD8明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，外科组、ESD组、联合治疗组CD4及CD4/CD8均明显升高，CD8明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与ESD组相比，联合治疗组CD4及CD4/CD8均明显升高，CD8明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表4。

2.7 五组胃组织溃疡指数和溃疡抑制率比较 与对照组相比，模型组胃组织溃疡指数明显上升，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，外科组、ESD组、联合治疗组胃组织溃疡指数明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与ESD相比，联合治疗组胃组织溃疡指数明显降低，溃疡抑制率明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表5。

2.8 五组再生黏膜厚度比较 模型组大鼠胃组织再生黏膜厚度（115.79±8.64）μm明显低于对照组（394.75±12.13）μm，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组大鼠胃组织再生黏膜厚度相比，外科组（222.10±7.48）μm、ESD组（226.64±7.92）μm、联合治疗组（363.79±8.00）μm均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与ESD相比，联合治疗组大鼠胃组织再生黏膜厚度明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

胃癌是常见的恶性肿瘤，全世界范围内每年有超过50万人死于胃癌[10]。胃癌可发生于胃的任何部位，早期胃癌是指胃癌局限于胃黏膜或黏膜下层，不考虑病灶大小、有无淋巴结转移。根据胃癌组织浸润的深浅，将早期胃癌分为胃黏膜内癌和黏膜下癌。早期胃癌多数患者无明显临床症状，少数人有恶心、呕吐等，临床症状无特异性[11]。目前我国早期胃癌的发现率大约只有10%，早期胃癌治愈率可达90%，因此早诊断、早治疗对提高胃癌的治疗效果，降低病死率是非常重要的。近阶段胃癌的治疗方法主要为根治性手术、化放疗、中药治疗。其中根治性切除术是早期胃癌的首选方式，与普通手术治疗比较，治愈率高，损伤小，可改善患者生活质量。EGC内镜下治疗主要有两种方法，即内镜下黏膜切除术（EMR）和内镜黏膜下剥离术（ESD）。ESD是在EMR基础上发展起来的治疗EGC及癌前病变内镜下微创治疗新技术，整块切除率较高，病灶残留少，复发率低。ESD是通过黏膜下层剥离后将整个病变部位完整切除的一项技术，操作难度大、手术时间长，故并发症发生率较高，常见的并发症包括出血、穿孔、术后狭窄，且手术切除的病灶较深，术后往往形成深大的医源性溃疡，面积大，愈合时间长，影响患者术后恢复[12]。术后为了保证恢复效果，需加强正确的日常护理，给予充足的营养和丰富的维生素或服用抗肿瘤及补益作用的中药。胃ESD术后溃疡的病机为脾气不健、失于升清、火毒内炽、胃失和降等，病位在脾、在胃，应泻火解毒、和胃愈疡[6]，结果显示和胃愈疡方对胃ESD术后溃疡的修复有显著促进效果。

胃溃疡的发生和愈合与机体组织、血液中炎症因子密切相关[13]。TNF-α是由活化单核细胞产生的炎症因子，可促进其他细胞因子的继发性释放，并引起中性粒细胞活化，急性期蛋白生成，对局部细胞、黏膜造成攻击和损伤;IL-8属于内源性趋化因子家族，主要作用是在炎症病灶局部募集单核巨噬细胞、中性粒细胞，促进各类炎症因子的分泌，还可介导多种免疫细胞和炎症细胞的成熟与分化。研究表明，口服健脾、清热、化瘀类中药，可减轻TNF-α、IL-8、IL-6等炎症因子的表达，促进溃疡愈合。gzslib202204021630

CEA是一种广谱肿瘤标志物，在多数肿瘤患者体内表达都有升高，特别是胃肠道肿瘤，敏感性更高[14]。资料显示，各期胃癌患者血清中CEA阳性率为8%～62.5%，且阳性率与肿瘤分期预后有很大关系[15]。同时，CEA与胃癌手术后有无复发有一定关系，胃癌手术后患者血液中CEA含量会降低，如果CEA由阴性转为阳性，且效价逐渐增加，则提示有复发或转移。本研究通过对各组大鼠血液中CEA含量的表达研究，证明采用手术治疗或手术治疗联合中药治疗均可使血液中CEA含量降低，且联合治疗对胃癌的控制效果优于单一治疗组。

EGF是一种在细胞增殖和分化中起重要作用的分子，具有抑制胃酸分泌、增加胃黏膜血流量，增加黏膜细胞DNA、RNA及蛋白质的合成，促进损伤胃黏膜愈合等。PGE₂是首先被发现具有细胞保护作用的内源性物质，可通过增加胃黏膜黏液分泌、促进表面活性磷脂的释放、清除氧自由基等多种机制来保护胃黏膜。研究表明，溃疡愈合过程伴有明显的EGF和PGE₂表达，口服健脾、清热、化瘀类中药可促进血液中EGF和PGE₂表达，加快胃溃疡愈合速度[16]。

炎症细胞的浸润，促进上皮组织再生，改善瘢痕修复能力，提高再生黏膜结构成熟度的作用。再生黏膜组织成熟度的评价，主要包括再生黏膜的厚度、黏膜肌层缺损宽度、局部炎症细胞密度等[17]。本研究主要对各组大鼠胃组织溃疡指数、溃疡抑制率及再生黏膜的厚度进行检测，证明ESD联合和胃愈疡方对黏膜切除及溃疡部位修复有较好的促进效果。

综上所述，本研究证明ESD联合和胃愈疡方对早期胃癌大鼠具有较好的治疗效果，安全性较好，并对联合治疗方法的作用机制进行了初步研究，为临床上早期胃癌的治疗提供了一定的理论依据，但该治疗方法在临床应用上的安全性和有效性亟待进一步研究和论证。

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