外源褪黑素通过调控活性氧代谢减轻采后杏果实冷害

何 欢，刘昭雪，张亚琳，张欢欢，芦玉佳，朱 璇

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

杏（Prunus armeniacaL.）属蔷薇科、李属[1]。新疆是杏的重要起源地和栽培中心，拥有丰富的种质资源[2]。据统计，新疆杏树在2018年种植面积约为11.13万 hm2，占全疆果树种植面积的11.66%，杏果实产量约为93.3万 t，占疆内水果总量的9%[3]。杏是典型的呼吸跃变型果实，在贮藏期极易腐烂[4]。虽然低温贮藏可以有效控制杏果实的腐烂，但由于杏的冷敏特性，在冷藏期间易发生冷害，出现果皮水渍斑、果肉褐变及絮败等冷害症状，严重影响可食性和商品价值，使低温贮藏技术在杏果实的应用上受到限制[5-6]。因此，研究采后杏果实的冷害机理、探索控制杏果实冷害的技术已成为其贮运产业中亟需解决的问题。

褪黑素，化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺，是所有植物都具有的一种内源吲哚胺类化合物[7]。有关植物褪黑素的研究表明，其作为一种多功能的生物信号分子，参与植物生长、发育、成熟及衰老的生理调节，在植物非生物胁迫过程中也起着重要作用[8-11]。近年来，褪黑素在果蔬采后处理上的应用越来越多。外源褪黑素在延缓草莓[12]、番茄[13]、樱桃[14]果实的后熟衰老进程，提高樱桃番茄[15]、香蕉[16]等果实的抗病性，抑制荔枝[17]果实的褐变，增强黄瓜[18]、桃[19]果实抗冷性方面的显著作用也被相继报道。此外，褪黑素可通过诱导抗氧化酶、非酶抗氧化剂和与氧化蛋白修复相关的酶来消除采后果蔬中过多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），保护果蔬免受氧化损伤[10]。Jannatizadeh[20]发现褪黑素减轻石榴果实冷害可能是因为其能够提高果实超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxide，APX）活性，维持ROS平衡。基于这些发现，推测褪黑素调控ROS稳态可能对减轻采后果实冷害有积极的影响。

ROS代谢失调被认为是导致冷害发生的机制之一[21]，外源褪黑素处理是否可以通过调节ROS代谢来增强采后杏果实抗冷性还鲜见系统报道。本研究以‘赛买提’杏为实验材料，采用不同浓度的外源褪黑素对杏果实进行减压渗透处理。筛选出外源褪黑素增强杏果实抗冷性的最适浓度，并从ROS代谢的角度揭示褪黑素处理减轻杏果实冷害的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究供试杏品种为‘赛买提’杏，于2019年6月19日采自新疆库车县乌恰镇杏果园。采收时选取硬度（23.0±0.5）N、可溶性固形物质量分数13.5%～14.0%、无病虫害、无机械损伤、大小均一的果实，采摘后于12 h之内运回新疆农业大学果蔬采后生理与贮运实验室，于5 ℃下预冷24 h。

褪黑素（粉剂，纯度≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α-萘胺、丙酮、浓硫酸、四氯化钛、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、氮蓝四唑、核黄素、L-蛋氨酸、磷酸氢二钠均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204-IC电子分析天平、FE22-Meter pH计 瑞士梅特勒-托利多仪器公司；UV-1700紫外分光光度计 上海美析仪器有限公司；DDS-307电导率仪 上海仪电科学仪器有限公司；HB-III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；3H16RI高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；DZKW-S-6电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

采用浓度50、100、200 μmol/L的褪黑素溶液（含体积分数0.05%乙醇），每组处理用果15 kg。杏果实与褪黑素处理溶液的质量比为1∶1，用减压渗透[4]的方式处理杏果实，将浸泡有杏果实的不同浓度褪黑素溶液抽气减压至0.05 MPa保持2 min，后恢复常压继续浸泡8 min，以蒸馏水处理作为对照组。处理后的果实在20 ℃环境下自然晾干，再置于冷库低温贮藏（温度（0±1）℃、相对湿度90%～95%），贮藏期为49 d，每7 d进行实验取样及相关指标的测定。

1.3.2 冷害发病率及冷害指数的测定

核果类果实最初的冷害症状为果核周围的果肉褐变，杏果实冷害等级以果肉褐变面积来界定[22]：0级，无褐变；1级，褐变面积比例0～5%；2级，褐变面积比例5%～25%；3级，褐变面积比例25%～50%；4级，褐变面积比例大于50%。冷害指数按式（1）计算。

以单个果实出现冷害等级达1级以上计为发病果，每个处理观察20 个杏果实，统计发病个数占总果数的比例，即为冷害发病率。

1.3.3 丙二醛含量的测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定参照Carvajal等[23]的方法，并稍作修改。取2 g果实样品加入5 mL预冷的5 g/100 mL三氯乙酸溶液，离心后将上清液和硫代巴比妥酸混合，并在沸水浴中反应20 min，分别于420、532、600 nm波长处测定上清液的OD值。MDA含量单位为nmol/L。

1.3.4 细胞膜渗透率的测定

细胞膜渗透率的测定参照Mao Lichun等[24]的方法，稍作修改。从10 个果实的赤道部分切下20 个圆片（直径5 mm），放入烧杯中，加入20 mL去离子水。摇动后立即用电导率仪测定果实的电导率（ρ0/（μS/cm）），30 min后，煮沸5 min后测定电导率（ρ1/（μS/cm）），冷却后再次测定为（ρ2/（μS/cm））。细胞膜渗透率按公式（2）计算。

1.3.5 超氧阴离子自由基产生速率的测定

1.3.6 H2O2含量的测定

H2O2含量的测定参照Shadmani等[26]的方法，稍作修改。取2 g果实样品于反应液（含丙酮、浓氨水、四氯化钛）中，离心后，将沉淀溶于浓硫酸，在410 nm波长处测定OD值。H2O2含量根据标准曲线计算，单位为nmol/g，结果以鲜质量计。

1.3.7 SOD、CAT、POD活力的测定

SOD活力的测定参照Wayne等[27]的方法，通过抑制硝基蓝四唑（tetranitroblue tetrazolium chloride，NBT）光化学还原的能力来分析其活力，以每克鲜质量果实样品每分钟的反应体系NBT被光还原50%为1 个SOD活力单位（U）。

CAT活力测定参照Shadmani等[26]的方法，以每克鲜质量果实样品每分钟引起反应体系在240 nm波长处吸光度增加0.01为1 个CAT活力单位（U）。

过氧化物酶（peroxidase，POD）活力的测定参照曹建康等[28]的方法，以每克鲜果实样品每分钟吸光度增加0.01为1 个POD活力单位（U）。

以上酶活力单位均为U/g。

1.4 数据处理与分析

每组实验设3 个平行，使用Excel 2010软件整理数据，结果以平均值±标准差表示。采用Origin 8.5软件制图，采用SPSS 26.0软件差异显著性分析（最小显著性差异检验）和皮尔逊相关性分析。

2 结果与分析

2.1 外源褪黑素对冷藏杏果实冷害发病率的影响

由图1可知，在贮藏前期，各处理组均未发生冷害，之后各组杏果实的冷害发病率都随着贮藏时间的延长呈上升的趋势。28 d时，对照组和50 μmol/L褪黑素处理的杏果实开始出现冷害，100、200 μmol/L褪黑素处理的杏果实在35 d开始发生冷害。3 个浓度褪黑素处理组杏果实冷害发病率在发生冷害的整个贮藏过程中都显著低于同期对照组（P＜0.05）。50、100、200 μmol/L褪黑素处理组在贮藏结束时的冷害发病率分别比对照组降低了15.38%、53.85%和33.33%。结果表明，褪黑素处理可以推迟杏果实冷害的发生时间，且能显著降低冷害发病率，100 μmol/L褪黑素处理降低冷害发病率的效果最佳。

图1 褪黑素处理对冷藏杏果实冷害发病率的影响Fig. 1 Effect of exogenous melatonin on the incidence of chilling injury in apricot fruit during cold storage

2.2 外源褪黑素对冷藏杏果实冷害指数的影响

如图2所示，发生冷害后，随着贮藏时间的延长，杏果实冷害指数不断增加，但3 个浓度褪黑素处理组的冷害指数显著低于同期对照组（P＜0.05）。50、100、200 μmol/L褪黑素处理组在贮藏末期的冷害指数分别比对照组低33.06%、53.34%和45.80%。结果表明外源褪黑素处理杏果实可以抑制冷害指数的上升，以100 μmol/L褪黑素处理效果最优。

通过以上实验结果可以得出，100 μmol/L褪黑素减轻杏果实冷害作用的效果最佳。因此，在后续研究中选取100 μmol/L褪黑素处理的杏果实，探讨外源褪黑素处理对采后杏果实冷害和ROS代谢的影响。

图2 褪黑素处理对冷藏杏果实冷害指数的影响Fig. 2 Effect of exogenous melatonin on the chill injury index of apricot fruit during cold storage

2.3 外源褪黑素对冷藏杏果实MDA含量的影响

MDA含量可作为判断膜脂过氧化程度的一个主要指标。如图3所示，杏果实的MDA含量随贮藏期的延长而持续增加。在整个贮藏期，褪黑素处理的杏果实MDA含量上升速度显著低于同期对照组（P＜0.05）。在贮藏49 d时，对照组和褪黑素处理组的MDA含量分别为采收当天的1.57 倍和0.75 倍，褪黑素处理组杏果实的MDA含量比对照组低46.44%（P＜0.05）。说明褪黑素处理可明显抑制杏果实贮藏期MDA含量上升。

图3 褪黑素处理对冷藏杏果实MDA含量的影响Fig. 3 Effect of exogenous melatonin on MDA content of apricot fruit during cold storage

2.4 外源褪黑素对杏果实细胞膜渗透率的影响

在低温逆境下，果蔬的膜相由液晶态转变为凝胶态，导致膜透性增加，膜内电解质外渗，所以细胞膜渗透率是判断冷害伤害程度的最直接指标。由图4可知，杏果实的细胞膜渗透率随贮藏期的延长呈上升趋势。在整个贮藏期，褪黑素处理杏果实的细胞膜渗透率均显著低于同期对照组（P＜0.05）。杏果实贮藏初期的细胞膜渗透率为15.71%，在贮藏49 d时，对照组和褪黑素处理组果实的细胞膜渗透率分别上升到70.10%和44.62%，其中对照组杏果实的细胞膜渗透率是褪黑素处理组的1.57 倍（P＜0.05）。结果表明褪黑素能有效抑制杏果实冷藏期间细胞膜渗透性的增加。

图4 褪黑素处理对杏果实细胞膜渗透率的影响Fig. 4 Effect of exogenous melatonin treatment on cell membrane permeability in apricot fruit

2.5 外源褪黑素对冷藏杏果实产生速率的影响

2.6 外源褪黑素对冷藏杏果实SOD活力的影响

图6 外源褪黑素对冷藏杏果实SOD活力的影响Fig. 6 Effect of exogenous melatonin on SOD activity of apricot fruit during cold storage

2.7 外源褪黑素对冷藏杏果实H2O2含量的影响

H2O2是最稳定的ROS自由基，冷胁迫刺激会使其过度积累，引起膜脂过氧化。如图7所示，在整个贮藏期间，两组杏果实H2O2含量均随采后贮藏时间的延长而升高，但褪黑素处理组杏果实的H2O2含量均低于同期对照组。贮藏28 d时，对照组和褪黑素处理组的杏果实H2O2含量分别是47.184 nmol/g和33.420 nmol/g，褪黑素处理组比对照组低29.17%（P＜0.05）。在贮藏结束时，杏果实的H2O2含量达到最大值，褪黑素处理组比对照组低17.96%（P＜0.05）。说明外源褪黑素处理可以显著抑制杏果实H2O2的积累。

图7 外源褪黑素对冷藏杏果实H2O2含量的影响Fig. 7 Effect of exogenous melatonin on the H2O2 content of apricot fruit during cold storage

2.8 外源褪黑素对杏果实CAT活力的影响

图8 外源褪黑素对杏果实CAT活力的影响Fig. 8 Effect of exogenous melatonin on CAT activity of apricot fruit during cold storage

由图8可知，对照组和褪黑素处理组的杏果实CAT活力随贮藏时间的延长呈先快速上升后下降的趋势。贮藏7 d时，褪黑素处理组的杏果实CAT活力达到最大（15.289 U/g），比同期对照组高46.38%（P＜0.05）。贮藏至21 d时，褪黑素处理组的杏果实CAT活力是对照组的1.74 倍（P＜0.05）。结果表明，与对照组相比，外源褪黑素处理的杏果实能保持较高的CAT活力。

2.9 外源褪黑素对冷藏杏果实POD活力的影响

POD是植物体内普遍存在的一种氧化还原酶，可与CAT协同作用，将H2O2分解为水和分子氧，减少H2O2的积累。由图9可知，杏果实POD活力随贮藏时间的延长呈先上升后下降趋势。褪黑素处理的杏果实POD活力在整个贮藏期间均显著高于同期对照组（P＜0.05）。贮藏28 d时，褪黑素处理组的杏果实POD活力达到最大值，是同期对照组的1.28 倍。贮藏至49 d时，褪黑素处理组的杏果实POD活力比对照组高15.56%。说明外源褪黑素处理能延缓杏果实的POD活力降低。

图9 外源褪黑素对冷藏杏果实POD活力的影响Fig. 9 Effect of exogenous melatonin on POD activity of apricot fruit during cold storage

2.10 杏果实冷害发病率、冷害指数与不同指标之间的相关性分析

表1 杏果实冷害发病率、冷害指数与不同指标之间的相关性分析Table 1 Correlation analysis of chilling injury incidence and chilling injury index in apricot fruit with different indexes

如表1所示，冷害发病率、冷害指数与活性氧水平（H2O2含量、产生速率）呈极显著正相关，与MDA含量、细胞膜渗透率呈显著或极显著正相关。此外，H2O2含量与MDA含量、细胞膜渗透率也呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.988、0.989。

3 讨 论

因品种、采收成熟度而异，杏果实的冷害症状繁杂，且在低温贮藏时不易被及时发现，冷害后的果实更易患侵染性病害，最终导致果实贮藏品质下降，降低了商品价值和营养价值[29-30]。本实验中，不同浓度（50、100、200 μmol/L）褪黑素均能有效抑制杏果实的冷害，延缓果肉褐变和表皮水渍斑等冷害症状的出现，推迟冷害发生，且以100 μmol/L褪黑素处理延缓杏果实冷害的效果最佳。在桃[31]和番茄[32]果实的研究中也发现采用100 μmol/L褪黑素处理可提高果实的抗冷性，维持贮藏品质。这表明，适宜浓度的外源褪黑素处理可以有效抑制冷敏性果实发生冷害。

已有研究发现，植物组织发生冷害的初始反应为膜脂的相变，膜脂从液晶态转变为凝胶态，导致膜结构和功能发生变化，膜内电解质渗漏，进而引发一系列次级反应[33]。所以细胞膜渗透率和MDA含量是衡量低温胁迫对细胞膜伤害程度的重要指标。相关性分析结果表明，冷害指数、冷害发病率与细胞膜渗透率和MDA含量呈显著或极显著正相关（P＜0.05、P＜0.01）。本实验中，外源褪黑素能有效抑制杏果实低温贮藏过程中细胞膜渗透率和MDA含量的增加。说明外源褪黑素处理可维持膜的稳定性，有利于缓解低温对杏果实细胞膜的伤害。胡苗[34]和Liu Changhong[35]等将褪黑素应用于猕猴桃、草莓果实采后贮藏中也得到相同的结果。

低温诱导的植物伤害通常涉及ROS的产生和消耗之间的失衡[36]。H2O2和等ROS过度积累会不可逆地损害叶绿体和线粒体等细胞器，保护细胞免受胁迫下的氧化伤害被认为是植物抵抗低温的一个主要机制，而这种抗性可能取决于抗氧化系统的能力[37]。酶促抗氧化系统是控制ROS产生的主要渠道，而SOD、CAT、POD是清除ROS的关键抗氧化酶[38]。其中，SOD在自发和极快速的反应中将分解为H2O2和氧[37]；CAT和POD进一步分解H2O2[39]。这3 种抗氧化酶协同降低H2O2和对细胞膜的氧化损伤，维持细胞膜的完整性，从而减轻果实的冷害。本研究中，褪黑素处理可显著提高杏果实的SOD活力，有效降低的产生速率，同时维持较高CAT和POD活力，从而抑制H2O2的积累。相关性分析结果表明，冷害指数与H2O2含量（r＝0.893）、产生速率（r＝0.960）呈极显著正相关（P＜0.01），H2O2含量与MDA含量（r＝0.988）、细胞膜渗透率（r＝0.989）呈极显著正相关（P＜0.01）。说明ROS的积累与膜脂过氧化、冷害加剧密切相关，减轻杏果实氧化应激是维持细胞膜完整性、提高抗冷性的基础。结果表明褪黑素可能在杏果实的抗氧化平衡中起着重要作用，维持细胞氧化还原稳态，从而调节ROS的对果实毒性，降低膜脂过氧化程度，缓解低温对生物膜的伤害，减轻冷藏期间杏果实的冷害，这与Cao Shifeng等[40]的研究结果相似。Mirshekari等[41]也证实褪黑素处理增强果实的抗冷性与调控SOD、CAT、POD等抗氧化酶活力，抑制ROS的积累，保持ROS代谢的平衡有关。以上这些结果表明，褪黑素作为介导酶类抗氧化剂抗氧化能力的信号分子，其卓越的ROS清除级联反应作用，可激活ROS清除酶活力，进而降低ROS的积累，这可能是改善园艺作物冷藏期氧化应激的关键。

综上所述，外源褪黑素处理可以通过调节ROS代谢有效减轻杏果实冷害。本研究结果表明，采后应用褪黑素可以通过提高SOD、CAT、POD等ROS清除酶的活性，降低H2O2和的积累，减轻膜脂过氧化程度，从而增强杏果实的抗冷性。说明外源褪黑素处理减轻杏果实的冷害与调控ROS代谢密切相关。