MMP-3-1171基因多态性与新疆地区汉族和维吾尔族骨关节炎的关系

陈家瀚，李彦奇，王鑫，史晨辉

(石河子大学医学院第一附属医院骨科中心，新疆 石河子 832000)

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的慢性致残性关节疾病[1]，其病变主要累积于关节负重区并逐渐向周围骨及软组织蔓延，造成关节内软骨及软骨下骨的持续性破坏，滑膜炎反复出现，最终导致关节间隙消失与关节畸形。膝关节是OA最常见的累及部位，主要临床表现以疼痛及活动受限为主，亦是OA患者主要就诊的原因。据统计全世界OA患者已达约3亿人，其中65岁以上人群OA的患病率甚至达到50%，已经成为中国第四大致残性疾病，造成严重的社会经济成本损失[2-3]。虽然OA主要与人体衰老有关，但它也与多种风险因素相关，包括遗传易感性、生物遗传因素、性别、肥胖、运动、创伤等[4]，且OA的患病率亦在不同地区，不同民族存在差异[5-6]。目前骨性关节炎的治疗推荐以综合治疗为主，包括物理、心理和(或)药物治疗[7]，但其主要目的均是以减少关节疼痛，延缓疾病进展为主，对于晚期患者只能通过关节置换来恢复关节功能，因此，对于骨性关节炎的早期预防和诊断变得日益重要[8]。

多项研究表明，基质金属蛋白酶族群(MMPs)与骨性关节炎的发生与发展密切相关。基质金属蛋白酶-3(MMP-3)主要是通过降解重塑细胞外基质(Extra-cellular matrix,ECM)参与骨性关节炎的病理过程[9-10]。Abd-Allah等研究报道埃及人群中基质金属蛋白酶-3(MMP-3)启动子区-11715A/6A基因多态性可能是OA的相关易感因素[11]，且5A等位基因频率明显高于亚洲人群的基因频率。而Sittisak Honsawek等[12]认为其多态性与泰国人群OA并无关联。因此，笔者推测MMP-3-11715A/6A基因多态性可能存在不同民族差异性，且其基因多态性可能是OA的相关易感因素。本研究旨在通过基因检测技术，研究MMP-3-11715A/6A基因多态性和新疆部分地区汉族人群及维族人群OA之间的关系，寻找汉族、维族关于OA方面的基因的差异性。

1 材料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象

选取2019年10月至2020年10月在石河子大学第一附属医院、图木舒克、喀什市第三师人民医院、51团医院关节科住院及门诊确诊的OA患者为研究对象，其中汉族OA患者111例(年龄在50～85岁之间，平均年龄59.66岁)，维族OA患者105例(年龄在50～80岁之间，平均年龄57.61岁)。对照组选取相同时间采集的门诊及体检健康的患者作为研究对象，其中汉族NOA对象217例(年龄在50～79岁之间，平均年龄57.61岁)；维族健康对象201例(年龄在50～76岁之间，平均年龄57.28岁)。

1.1.2 纳入标准

(1)根据2018年中华医学会骨关节炎诊断及治疗指南的诊疗标准，OA组的诊断经临床检查(症状、体征、X线/CT)确诊；(2)居住在新疆地区的汉族及维吾尔族OA患者及同期体检对象；(3)年龄高于50岁；(4)患者或其家属对本研究知情并签署相关的知情同意书。

1.1.3 排除标准

询问采集者既往病史，通过病史判断排除继发性OA，任何类型的系统性炎症，任何类型的自身免疫性疾病，任何类型的恶性疾病的患者。

1.2 主要仪器与试剂

PCR热循环仪(Bio-Rad PCR Thermal Cycler，America)，低温高速离心机(Beck Man Microfuge 20，America)，F-90型多功能暗箱紫外透射仪，紫外分光光度计(Thermo Scientific NanoDrop，America)2%琼脂糖凝胶，凝胶成像分析仪；血液基因组DNA试剂提取盒(TianGen Biotech，Beijing)，限制性内切酶PsyⅠ(SibEnzyme，Russia)，rs3025058基因PCR上下游引物(BioMed，Beijing)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

用EDTA-Na2收集管静脉采集所有研究对象血液标本约4 mL，采集完毕后放置于低温冷冻冰箱保存，按照血液基因组试剂盒说明书上的步骤进行DNA提取制作，提取完毕的DNA样本检测DNA纯度，收集纯度合格样品继续保存于冷冻冰箱，对纯度不合格的样品重新提取DNA。

1.3.2 MMP-3基因扩增

PCR引物序列委托BioMed基因公司设计合成。正向引物：5′-CAG AGG TTT CAC TAT GTT GCC CAG G-3′；反向引物：5′-ATT AGA GCT GCC ACA GCT TCT ACA C-3′。本研究的反应体系:加入2 μL的PCR 缓冲液，1.2 μL的MgCl2+溶液，2.5 uL的DNA聚合酶，0.5 μL的dNTPs，目标DNA 100 ng，2.5 μL上游引物、2.5 μL下游引物，剩余dH2O加至20 μL。本研究所使用的反应条件：94 ℃ ×10 min，94 ℃ ×30 s，53 ℃ ×30 s，72 ℃ ×45 s，完成循环35次，72 ℃×7 min。紫外透射仪检测凝胶电泳结果，通过限制性内切酶PsyⅠ在37 ℃恒温水浴过夜后鉴定其基因型(图1)，随机抽取部分样本进行基因测序，与酶切结果比对验证(图2)。

图1 3种不同基因型的凝胶电泳图

图2 MMP-3-1171位点基因型测序图

1.3.3 统计学处理

2 结果

2.1 参与者数量分析

本研究共纳入634名参与者，其中汉族人群骨性关节炎患者111例(33.84%)，汉族人群对照组217例(66.16%)，维吾尔族人群骨性关节炎患者105例(34.31%)，维吾尔族人群对照组201例(65.69%)，收集所有测试结果。

2.2 一般特征资料比较

汉族骨性关节炎组和对照组之间的一般计数和计量资料均无统计学差异(P>0.01)，维族骨性关节炎组和对照组间年龄、身高、体重、性别差异均无统计学差异(P>0.01)，维族骨性关节炎组和对照组的 BMI 差异有统计学意义(t=3.024，P<0.01)(表1)。

表1 一般资料比较

2.3 凝胶电泳结果

将提取的DNA加样至2%琼脂糖凝胶电泳中跑样并在凝胶成像仪中成像观察并记录。随后进行PCR扩增，经限制性内切酶PsyⅠ在37 ℃水浴过夜后，再次通过凝胶成像仪观察并鉴定其基因型。其中6A/6A基因型含有129 bp 1个条带；5A/6A基因型含有129 bp、96 bp、32 bp 3个条带；5A/5A基因型者，只含有96 bp、32 bp 2个条带(图1)。

2.4 Hardy-Weinberg平衡分析

根据H-W定律各民族骨性关节炎组和对照组中基因位点实际值与预测值比较差异无统计学意义(P>0.05)，各组遗传稳定，属于同一群体(表2)。

表2 Hardy-Weinberg遗传平衡差异性检验

2.5 MMP-3-1171 5A/6A位点基因的多态性与汉族和维族骨性关节炎的关系

应用卡方检验，其中维族人群中MMP-3-11715A/6A的基因型和等位基因频率在骨性关节炎组和对照组之间差异有统计学意义(χ2=9.317和10.648和，P<0.01)，且与6A等位基因相比，5A等位基因显著提高维族OA人群的发病风险(OR=1.833，95%CI=1.271～2.645)。汉族OA组与维族OA组之间MMP-3-11715A/6A基因型及等位基因频率有统计学差异(χ2=11.206和8.526，P<0.01)，其中维族OA患者的5A基因型频率(35%)明显高于汉族患者(23%)，且维族OA患者MMP-3-11715A等位基因可以显著增加维族OA患者发病风险(OR=1.833，95%CI=1.271～2.645)(表3)。

表3 不同基因型与等位基因频率的相互比较

2.6 维族MMP-3-1171位点 5A/6A 等位基因频率与骨性关节炎的关系

以维族MMP-3-11715A/6A等位基因频率(等位基因5A=1，等位基因6A=0)、BMI为自变量，以骨性关节炎为因变量(OA=1，NOA=0)，采用多因素逻辑回归模型校正文组人群的BMI后分析，结果显示MMP-3-1171-5A等位基因可增加骨性关节炎的发病风险(OR=1.793，95%CI=1.270～2.532)(表4)。

表4 维族人群多因素 Logistic 回归分析结果

3 讨论

目前，对于OA的遗传病因及分子机制仍是研究热点，基质金属蛋白酶-3(MMP-3)也称基质溶解素(stromelysin1)，定位人类染色体11q22.3基质金属蛋白酶基因簇，是一种可由多种人体细胞分泌的细胞基质内肽酶，是在OA软骨中表达最多的MMPs之一，主要参与细胞外基质(ECM)的降解，并通过水解作用激活各种MMPs，以及在软骨蛋白多糖释放中起到重要作用[10-13]。因此，MMP-3的过度表达可以通过水解激活其他MMPs和影响细胞外基质来造成骨性关节炎的病理环境。多项研究表明，MMP-3在早期和中期骨性关节炎关节内及血清中的水平呈高表达，并且MMP-3的表达与OA的严重程度呈正相关[14-16]。

有关MMP-3基因启动子1171位点5A/6A基因多态性于1996年首次由Ye等[17]报道，其最先发现该多态性与多种心血管疾病相关，如脑梗死，急性冠脉综合征，急性脑卒中等，后该单核苷酸多态性(SNP)被证实与其它多种疾病存在相关性。根据报道，启动子区1171位点的5A/6A基因可能与MMP-3的表达水平存在相关性，其中6A等位基因可能造成水解酶活性减少从而导致MMP-3转录水平下降，而5A等位基因相较于6A不会降低关节腔及血清中的MMP-3水平[18]，因此可能进一步促进骨性关节炎的产生与发展。Abd-Allah等人首次报道埃及人MMP-3-11715A/6A基因多态性与OA存在易感性关系[11]，而Sittisak Honsawek等人[12]认为其多态性与泰国人群OA并无关联。

本研究结果显示，我国新疆地区汉族和维族的基因多态性分布频率，均以6A/6A基因型分布为主。在OA组中，维族5A等位基因频率(35.2%)明显高于汉族(22.5%)，统计学存在差异(χ2=8.526，P<0.01)。在NOA组中，汉族5A等位基因频率(17.1%)与维族(22.9%)相似,与其他文献中报道的蒙古人种，如汉族(20%)和日本人(12%～21%)频率相似[19-20]，明显低于欧罗巴人种如埃及(52%)和英国人(50%)的报道[11]。提示该基因的多态性存在人种分布差异[21]，可能影响该基因单核苷酸多态性相关疾病的患病风险。维吾尔族作为新疆人口数第一的民族，其基因型频率与亚洲人群的基因型相似，但在两组骨性关节炎人群中，维族5A基因占比却显著高于汉族人群，这说明维族可能对于MMP-3-11715A基因存在相关易感性，但与人群分布无关。

关于MMP-3-11715A/6A在汉族与维族人群中的易感性，本研究显示，维吾尔族人群中OA组的基因型及等位基因频率与NOA组的基因型及等位基因频率存在统计学差异(χ2=9.317和10.648，P<0.01)，通过多因素逻辑回归分析校正维吾尔族人群的BMI影响，结果显示5A等位基因是维吾尔族骨性关节炎的独立危险因素(OR=1.793，CI=1.270 ～2.532)，这提示携带5A基因维吾尔族人群患骨性关节炎风险增高，这可能是由于携带5A等位基因的维族人群关节内MMP-3的表达水平较高。但是研究结果表明携带5A等位基因的汉族OA人群与NOA人群无统计学差异，这可能是由于汉族与维族之间饮食文化及生活习惯等其他风险因素影响有关，也可能与汉族5A基因携带者数量较少，研究样本量较小有关，限制了相关性的统计功效，存在一定局限性。这种民族之间的基因差异，需要进一步扩大样本含量，多中心采集患者数据来得到更具有代表性的数据信息。总之，虽然OA主要受年龄，体重等因素影响，但遗传因素也起了不容忽视的作用，MMP-3-1171位点5A等位基因可能增加维族人群OA的患病风险，对于其发生、发展机制值得深入研究。