绵羊多杀性巴氏杆菌A 型、F 型与溶血性曼氏杆菌A 2 型混合感染的诊断与防治

金映红，陈古丽，李 威，夏 俊，汪 萍，苗书魁，汪 阳，李璋赟，古丽扎提·塔力甫汗，木克日木·帕尔哈提，薛 晶*

(1. 新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐 830000；2.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，乌鲁木齐 830000；3.新疆农业大学，乌鲁木齐 830000；4.石河子大学；新疆 石河子 832003)

溶血性曼氏杆菌(Manheimia haemolytica, Mh)和多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)是巴氏杆菌科的典型细菌，属于革兰氏阴性菌，存在于牛、绵羊和山羊等反刍动物中，是上呼吸道的常见细菌。Pm 常引起羊的出血性败血症、牛出败、猪肺疫和禽霍乱等严重性疾病，尤其羊的发病率、致死率高[1，2]。 曼氏杆菌曾被称为溶血性巴氏杆菌，是一种严重威胁畜牧业的人畜共患病原体[3]，临床上可导致绵羊出血性败血症等严重疾病。

一般认为，畜禽往往携带内源性细菌，当出现养殖环境不卫生、天气忽冷忽热、活动空间狭小、营养不良、因天气原因放养变成圈养等诱因时，羊会引发应激反应。 当动物抵抗病原菌的能力下降时，细菌就侵入动物体内，通过呼吸道和淋巴管进入血液，引发内源性感染[4，5]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

采自新疆某羊场病死羊的肺组织。

1.1.2 主要试剂和实验动物

BHI 脑心浸液、革兰氏染色液、各种PCR 所需的酶、DL2000 核酸Marker、药敏纸片均购自赛奥生物医学科技有限公司；健康巴贝斯小鼠6 只，购自新疆农业大学。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离

将从羊场采集到的病变组织肺脏分别接种到BHI 液体和固体培养基中进行培养，24 h 后观察菌液的生长情况。

1.2.2 细菌鉴定

1.2.2.1 形态观察 1.2.1 中的肉汤变浑浊，表明增菌成功，革兰氏染色镜检并拍照记录。挑取固体平板上光滑、湿润、透明的疑似巴氏杆菌的菌落，接种到脑心浸液肉汤，37 °C，150 r/min，水平振荡培养，24 h 后染色镜检，观察形态，选择纯化后的菌液进行下一步实验。

1.2.2.2 PCR 扩增 PCR 鉴定采用巴氏杆菌A 和F 型，曼氏杆菌A2 型的引物，扩增体系25 μL：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 补至25 μL，标记好后放到PCR 扩增仪中。经优化后的反应条件如表1[6，7]。

表1 PCR 扩增反应条件

1.2.2.3 测序结果比对 PCR 产物电泳，目的条带切胶回收，送生工生物有限公司测序，测序结果在Blast搜索GenBank 中的同源序列，分析比较。

1.2.2.4 致病性试验 选6 只小鼠，其中3 只小鼠腹腔注射200 μL 纯化菌培养物作为实验组，另外3 只小鼠腹腔注射生理盐水200 μL 作为对照组，观察各组的食欲和精神状态[8]。

1.2.2.5 药敏实验 无菌取纯化的细菌混合液滴入固体平板，灭菌的涂布棒轻轻抹匀，接着将硫酸阿米卡星和头孢曲松钠等11 种药敏片轻轻贴附到培养基表面。 然后将平板放入温箱，24 h 后观察结果[9]。

2 结果与分析

2.1 细菌形态及培养特性

如图1 所示，3 株分离菌a、b、c 革兰氏染色，显微镜下可见a 和b 较小，c 较大，形状呈球形或杆状，有单个的、成对的和短链状排列的革兰氏阴性菌。固体平板上的菌落呈现半透明状，与疑似大肠杆菌的杂菌菌落有明显差异。

图1 分离菌革兰氏染色镜检

2.2 PCR 鉴定结果及分析

经PCR 扩增琼脂糖电泳结果显示，在1100 bp、875 bp 和900 bp 处均出现明亮条带，见图2，与预期相符，说明巴氏杆菌A 型、巴氏杆菌F 型和曼氏杆菌A2 型均呈阳性。

图2 PCR 鉴定结果

2.3 致病性实验结果

实验组的小鼠注射液体8 h 后表现精神萎顿，厌食，被毛粗糙。 在18 h 内相继死亡。 对照组小鼠精神状态良好，饮食正常。 见图3。

图3 3 株分离菌液小鼠攻毒试验

2.4 药敏实验结果

结果表明，混合菌液对左旋氧氟沙星、乳酸环丙沙星替敏感，对其余的药品不敏感。 见图4。

图4 混合菌液药敏实验结果

3 防 治

3.1 预防措施

首先要加强饲养管理，为羊群提供干净的饮水和食物，及时将畜舍和羊群活动的地方进行清理和消毒，定期带羊进行喷雾消毒；其次要定期免疫，细菌性疾病的常发地区要根据羊的品种、年龄、性别等注射疫苗，减少羊细菌性传染病的发生与传播；最后，无害化处理、圈舍消毒，也是很重要的一步。 发现有症状的羊后，应立即隔离，对病死的羊进行消毒、深埋无害化处理，彻底清洁整个羊场，清洁饲养设备。

3.2 治疗措施

对已感染的病羊， 建议畜主用2.5%的左旋氧氟沙星或乳酸环丙沙星按0.1 mL/kg～0.2 mL/kg 体质量进行肌肉注射，连用4 d，或选用头孢噻肟、美洛西林、丁胺卡那霉素进行肌肉注射(用药量参照说明书)。当疫情缓解后，可以用该羊场分离的Pm 和Mh，制备二联疫自家菌苗给羊群接种，每只3 mL。

4 讨论

分离于新疆某羊场的病羊肺组织的3 株病原菌， 革兰氏染色呈球杆状，2 株较小，1 株较大，虽然曼氏杆菌归属于巴氏杆菌科，但是形态上曼氏杆菌相对较大；测序结果及同源比对，支持3 株菌分别是PmA 型、F 型与MhA2 型。 药敏实验结果得出混合菌对左旋氧氟沙星和乳酸环丙沙星敏感，这与刘顺磊[10]等的实验结果有差异。 究其原因，可能是抗菌类药物的种类和剂量有所不同；巴氏杆菌和曼氏杆菌的混合菌液对健康小鼠具有一定的致病力，表明其毒力相对较强；究其原因可能与动物的种类有关，后续可以在大型动物身上做进一步的研究，也可以设计相关实验，确定实验动物的半数致死量。

以往的文献表明，羊主要是以B 型Pm 感染为主，F 型的Pm 主要是感染火鸡。 但是近年来通过研究调查，我们发现羊的PmA 型比较多见，F 型也有，在新疆的流行病学调查，我们发现PmA 型和PmF 型以及MhA2 型，是导致羔羊死亡的重要病原，需引起高度重视。

5 结论

通过细菌分离鉴定、PCR 鉴定等实验判定该病死羊是PmA 型、F 型与MhA2 型混合感染，药敏实验判定该混合液对左氧氟沙星、乳酸环丙沙星敏感，小鼠致病性试验说明，3 株分离菌株对小鼠有很强的致病能力。 因此，养殖户在平时养殖中应坚持“防大于治”的原则，尽量预防疾病的发生，加强养殖场的疾病检疫相关检查，将经济损失减到最低。