食品中金黄色葡萄球菌的快速检测及其评估

谭慧林, 吴忠红, 金永生, 牛贵洋, 包东东, 陈海元, 张志东

(1. 新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091; 2. 新疆阿克苏食品安全检测中心，新疆阿克苏 843000； 3. 新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，乌鲁木齐 830091；4. 阿克苏地区检验检测中心，新疆阿克苏 843000)

0 引 言

【研究意义】金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界空气、水、土壤等环境中，其繁殖过程中会产生多种毒素和侵袭性酶。近年来，由金黄色葡萄球菌引起的感染已占世界第二位[1-5]。强化食品中的金黄色葡萄球菌检测和相关风险监控，对于消除重大食品安全隐患有重要意义。【前人研究进展】目前，金黄色葡萄球菌的检验方法有传统微生物学培养法[6]、免疫法[7-8]和核酸检测法[9-10]、生物传感器检测法[11]等。【本研究切入点】依照国标GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》，传统培养法是检验机构检测食品中金黄色葡萄球菌普遍采用的方法，其检测结果准确，但检测周期长、过程繁琐。选用简单、快速、有效、准确的金黄色葡萄球菌的检测方法，对提高食品安全检验和尤为重要。目前，采用凝胶培养法的金黄色葡萄球菌的快速检验已经建立，部分成熟可靠的技术已经商品化[12-15]，该方法简单、快速，但此类试剂盒在食品检测中适用性和准确度尚无相关评估。【拟解决的关键问题】采用国标方法GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》和国家食品药品监督管理总局《食品快速检测方法评价技术规范》[16]，测定选用的2种食品中金黄色葡萄球菌污染程度，并对其快检试剂盒的灵敏度、特异性、假阳性率和假阴性率进行分析，评估该快检试剂盒，为金黄色葡萄球菌的快筛检验提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

所用苹果脆片、真空包装玉米，购自乌鲁木齐市新疆农业科学院周边。

金黄色葡萄球菌测菌株(Staphylococcusaureus，ATCC25923)、表皮葡萄球菌菌株(Staphylococcusepidermidis， ATCC25285)、7.5%氯化钠肉汤、Baird-Parker 培养基、血平板、BHI 肉汤、营养琼脂、兔血浆冻干粉，北京陆桥技术股份有限公司；金黄色葡萄球菌快检试剂盒，广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司。

灭菌锅MJ78A，施都凯仪器设备(上海)有限公司；生化培养箱IPP260，美墨尔特(上海)贸易有限公司；生物安全柜HR50-IIA2，青岛海尔特种电器有限公司；均质器，生物梅里埃公司。

1.2 方 法

1.2.1 样品处理

无菌条件下，称取25 g样品置于盛有225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2 min，制成1∶10的样品匀液；吸取1∶10的样品匀液1 mL，加至盛有9 mL的生理盐水的无菌试管中，反复吹打混匀，制成1∶100的样品匀液。

1.2.2 国际方法计数测定

按照国标GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》中的检验流程，分别吸取1 mL样品匀液以0.3、0.3和0.4 mL接种量分别加入3块Baird-Parker平板，涂布后，可将平板正放在培养箱36℃±1℃培养1 h，样品匀液吸收后翻转平板，倒置后于36℃±1℃培养24～48 h。选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度2个平板上所有菌落数合计在20～200 CFU的平板，计数典型菌落数。

1.2.3 快检方法计数测定

依照快检试剂盒说明书，用无菌吸管吸取1 mL样品匀液，缓慢均匀地滴加到快检纸片上，然后再将其上层膜缓慢盖下，每个浓度重复10次。将测试片叠在一起放入自封袋中并封口，37℃，培养24 h后，计数统计，其中紫红色为金黄葡萄球菌，蓝色为其它菌群。

1.2.4 典型菌落的确认

从典型菌落中至少选5个可疑菌落进行鉴定。分别做染色镜检，血浆凝固酶试验。划线接种到血平板36℃±1℃培养18～24 h后观察菌落形态，并以表皮葡萄球菌作为对照。

1.2.5 快检方法评估

将金黄色葡萄球菌标准菌株接种到营养肉汤中，36℃培养 24 h，按照 1∶10 的比例进行梯度稀释，获得101～104CFU/mL菌悬液，分别添加至样品匀液中，采用参比方法和快检方法进行菌落数计数，依据《食品快速检测方法评价技术规范》的要求评价试剂盒的显著性差异、灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率、相对准确度。表1

1.3 数据处理

数据计算采用Mcirosoft Excel 2010进行。

2 结果与分析

2.1 样品中金黄色葡萄球菌的国际法检测

研究表明，所检测的苹果脆片中金黄色葡萄球菌含量为15～20 CFU/g，真空包装的水果玉米中为30～50 CFU/g，小于国家标准GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》要求规定即食果蔬制品金黄色葡萄球菌限量，检验的苹果脆片和水果玉米金黄色葡萄球菌均符合国标GB 29921-2013标准限量要求。表2

2.2 样品中金黄色葡萄球菌的快检方法检测

研究表明，苹果脆片中金黄色葡萄球菌含量为20～30 CFU/g，真空包装的水果玉米中为30～40 CFU/g。表3

2.3 不同人工污染水平金黄色葡萄球菌回收率

研究表明，回收率分别可达到93.3%和102.5%，回收率均高于90%，符合检测分析要求。表4

2.4 灵敏性实验、假阳性实验、假阴性实验

研究表明，因在同一批次产品中，检验的样品数为5个样品，最大可允许超出m值的样品数为1，其中可接受水平的限量值m值为100 CFU/g，最高安全限量值M为1 000 CFU/g。当金黄色葡萄球菌菌落数<100 CFU/g时为阴性样品。表5

灵敏度为93%，特异性为100%、假阴性率6.6%，假阳性率为0，显著性差异为0.5，相对准确度为96.7%。表6

表1 快速检测方法性能指标计算方法Table 1 The calculation of properties indexes of the rapid detection method

表2 国际法检测样品中金黄色葡萄球菌数量Table 2 Amount of S.aureus in the samplesby the standard method

表3 快检方法检测样品中金黄色葡萄球菌的数量Table 3 Amount of S.aureus in the samples by the rapid kit

表4 不同人工污染水平的金黄色葡萄球菌回收率Table 4 Average recovery in different spiked levels for S.aureus by the standard method

表5 快检法与国标法检测结果对比Table 5 Comparison of results detectedby the standard method and the rapid kit

表6 金黄葡萄球菌快检试剂盒的评估Table 6 Estimation and analysis the fast kit for S.aureusdetermination

3 讨 论

根据国内食品安全标准及食品安全监督抽检细则要求，其检测依据为GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学 检验金黄色葡萄球菌检验》。在GB 4789.10-2016中规定的3种检验方法中，最终都要求快速准确的从选择性平板Baird-Parker中挑取菌落，经纯化后进行血浆凝固酶实验。此方法要求检验员具有较强的专业知识和长时间的实验室操作经验，方能准确的找到目标菌，从而进行生化分析，否则，容易造成检验结果的误判和定量检验结果的不准确。在进出口检验检疫行业标准中，采用分子生物学检验食品中金黄色葡萄球菌的方法，主要参照为SN/T 4525.2-2016《出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第2部分：金黄色葡萄球菌》、SN/T 2754.1-2011 《出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第1部分：金黄色葡萄球菌》、 SN/T 4453-2016《出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型方法》，这些检验方法检出较快，但更需要专业的检验人员熟练操作复杂的仪器设备，且所用的仪器设备和专业试剂也很昂贵，不适合在基层实验室开展快速筛查工作。此次试验采用的金黄色葡萄球菌快检纸片，因加入了可与金黄色葡萄球菌显色的特异底物，使其培养后菌落呈现独特紫红色，可更加快捷的判断金黄色葡萄球菌，缩短了检验时间，且操作简便，不依赖复杂的仪器设备和专业的检验人员，具有快速、低成本的特点，适于对金黄色葡萄球菌的快速筛查，适合基层开展食品安全抽检的快速筛查，尤其是在食物中毒、应急处置等病原微生物鉴定方面快检具有良好的应用前景[18,19]。

根据行业标准SN/T 3266-2012《食品微生物检验方法确认技术规范》[20]，定性方法应达到如下性能指标：灵敏度≥98%，特异性≥90.4%，假阴性率<2%，假阳性率<9.6%, 相对准确度≥94%。同时，根据《食品快速检测方法评价技术规范》，显著性差异表示待确认方法与参比方法的一致性比较，当显著性差异X2<3.84，表示待确认方法与参比方法的阳性确证比率在95%的置信区间内没有显著性差异。此次实验灵敏度为93%，特异性为100%、假阴性率6.6%，假阳性率为0，显著性差异为0.5，相对准确度96.7%，其快检方法与参比方法的显著性差异为0.5，表示快检方法与参比方法在95%的置信区间内没有显著性差异。快检方法虽然灵敏度、假阴性率指标未达到《食品微生物检验方法检验方法确认技术规范》指标要求，但检测时间为36～48 h，比国标方法72 h提前了24 h以上，可在日常的抽检中能迅速寻找阳性样品，保障食品安全。

金黄色葡萄球菌检验结果的准确性，必须满足《食品微生物检验方法确认技术规范》的要求，也成为快检技术的关键[24]。试验中，当样品金黄色葡萄球菌数在临界值上时，此试剂盒的假阴性比较高，容易造成误判。在开发食品中金黄色葡萄球菌快检方法时, 开发快速准确的方法, 才能实现真正意义上的食品微生物的快速检测。但另一方面，在实际食品样品金黄色葡萄球菌检测中，长期受其检出率低困扰，在2018年大丰城区菜市场熟食中金黄色葡萄球菌的检出率5.26%[21]， 2010～2016年金黄色葡萄球菌的检出率为0.94%～4.11%[22]，2015～2016年淮安市食品中金黄色葡萄球菌检出率为6.65%[23]，而此次采用快检试剂盒在金黄色葡萄球菌的含菌量≥10 CFU/g时，可有效检出，可作为一种有效的快检手段，但当快筛数据显示异常时，应尽快将样品送至具有检验资质的实验室进行验证，有效降低食品安全风险。

4 结 论

4.1检测市售的苹果脆片和真空包装水果玉米，均符合GB 29921-2013《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》要求，两者检验结果一致。

4.2该试剂盒的灵敏度为93%，特异性为100%、假阴性率6.6%，假阳性率为0，显著性差异为0.5，相对准确度为96.7%，显著性差异为0.5，其与国际法检验结果一致性程度较高，且对实验环境要求较低，操作简单，检验成本低，缩短了检验时间, 适于日常食品安全监测工作和公共卫生突发事件处理的快速检测。