化学预处理与傅里叶变换红外光谱相结合分析棉花纤维细胞壁组分

胡文冉，杨 洋，李 波，郝晓燕，赵准，邵武奎，黄全生

(新疆农业科学院核技术生物技术研究所/新疆农作物生物技术重点实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】棉花纤维和其他植物细胞壁一样，都是由结构多糖和苯丙烷类化合物相互交联形成细胞壁交联结构[1,2]。其中形成植物细胞壁内交联结构的苯丙烷类化合物可保护细胞壁中的纤维素不易被化学和生物降解，可影响细胞壁的生长、强度、形态建成和对生物与非生物逆境的抗性[3-5]。棉花纤维是单细胞结构，其细胞壁结构物质生化组分的结构和性质必然直接影响棉花纤维的品质、产量及其利用价值。纤维素以束状小纤维的形态与纤维轴呈约为25～30o的螺旋角螺旋形倾斜，沿纤维长度呈时左时右的螺旋方向旋转，没有一定的规律性，在纤维吐絮干涸收缩时，形成不规则的天然扭曲[6]，天然扭曲增加了纤维之间的抱合力。棉花纤维具有纤维素含量高、延展性好、纤细柔软、难以研磨成粉状等特性。傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectrometer，FTIR)由于其分析测试的优点常用来分析植物细胞壁组分，但测试分析时需要将细胞壁样品磨成粉状，使样品细胞壁结构的表面暴露在测试扫描窗口，利于FTIR检测。棉花纤维由于其柔软、纤细等特殊性，使得其难以被直接研磨成粉末，限制了利用FTIR对棉花纤维结构组分的检测。研究棉花纤维细胞壁组分对于分析棉花纤维品质形成机理具有重要意义。【前人研究进展】研究棉花纤维时，尝试了粉碎机、切割、剪碎等方法尽量使纤维样品达到细碎状态，费时费力，用扫描电镜、荧光显微观察发现，采用这些方法处理的样品并不能使细胞壁中主要的次生壁结构充分暴露，FTIR分析时不能充分观察到植物细胞壁真实存在的组分[7]。化学方法处理棉花纤维样品，如采用硫酸、乙酰溴等化学物质处理时，硫酸将棉花纤维中的纤维素等非木质素部分溶解，只留下难溶于酸的木质素[8]，乙酰溴溶液在高温条件下将细胞壁交联结构物质中的化学键断裂，使得纤维样品溶解在乙酰溴溶液中[9]。【本研究切入点】这些处理均在一定程度上造成细胞壁组分的破坏；又如利用强碱进行化学预处理只能使纤维的结构形态发生变化，也不能使植物细胞壁真正破碎[10]，影响FTIR的后续检测结果。巯基乙酸法是一种用于分析植物细胞壁中苯丙烷类化合物含量的方法，其分析原理是巯基与苯丙烷类化合物结合，反应产物可溶与强碱中，利用强碱将苯丙烷类化合物从植物细胞壁中分离出来，而纤维素等其他成分不被溶解[11]。亟需提供一种能够与FTIR相结合的观察棉花纤维细胞壁组分的化学预处理方法，使细胞壁断裂破碎但不造成其组分结构破坏，以实现应用FTIR分析细胞壁的真实结构组分。【拟解决的关键问题】研究针对棉花纤维的特性，将纤维先用巯基乙酸和盐酸在高温条件下进行化学预处理，使得纤维细胞壁断裂，对破碎断裂后的棉花纤维粉末采用去离子水清洗，干燥后再结合FTIR对棉花纤维细胞壁主要是苯丙烷类化合物结构相关的组分进行分析，为研究棉花纤维等特殊植物细胞壁的特性提供新的技术参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 棉花品种

国内选育品种：TM-1、军棉1号、徐州142、中棉35号；新疆自育的早中熟品种：新陆中36号、新陆中37号、早熟品种新陆中13号、新陆早36号、新陆早39号；从美国引进的ACALA 1517共10个陆地棉品种的自然成熟纤维；3棵樟子松(PinussylvestrisL.var.mongolicaLitv)树枝枝条。

1.1.2 试剂与仪器

傅立叶变换红外光谱仪(Nicolet iS10 FTIR)；DKZ-2型电热恒温震荡水槽(上海精宏实验设备有限公司)；CR20B2型高速冷冻离心机(日立公司)；EYELA NDO-700定温恒温干燥箱(上海)；JSM6400扫描电子显微镜(SEM，日本)。

巯基乙酸(Sigma-Aldrich)；Tris-HCl(北京欣经科生物技术有限公司)；曲拉通X-100为分析纯(北京欣经科生物技术有限公司)；NaCl为分析纯(西安化学试剂厂)；丙酮为分析纯(郑州市德众化学试剂厂)；HCl为分析纯(北京化工厂)。

匀质缓冲液(50 mM Tris-HCl、1% (v/v)曲拉通X-100、1M氯化钠，pH8.3)。

1.2 方 法

1.2.1 棉花纤维样品处理

1.2.1.1 样品清洗

挑出棉花纤维中混入的非纤维叶片和种壳碎片等杂质后，称取1.0 g棉花纤维，用匀质缓冲液清洗2次，再分别用80%丙酮清洗2次和纯丙酮清洗1次。每次清洗都涡旋棉花纤维和清洗液，并反复挤压使棉花纤维和清洗液充分混合，最后将棉花纤维放在金属夹蒜器中挤出残留的液体，45℃烘干备用。

1.2.1.2 巯基乙酸和盐酸处理棉花纤维样品

参照文献[11,12]中对植物细胞壁中苯丙烷类化合物的提取方法进行。称取清洗并烘干的棉花纤维0.1 g，置于30 mL血清瓶内，加入5 mL 2 N HCl后再加入0.75 mL巯基乙酸，充分混匀后旋紧瓶盖，置于98℃水浴锅内轻缓震荡4 h；反应完成后取出血清瓶，冰上冷却20 min，将反应液转至50 mL离心管，室温下12 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀分别用10 mL蒸馏水清洗3次，45℃烘干备用。

1.2.1.3 棉花纤维样品切碎

用锋利的刀片反复切割清洗并烘干的棉花纤维成粉末状作为对照。

1.2.2 樟子松枝条处理

1.2.2.1 粉碎处理

樟子松枝条干燥后刮去其表皮、韧皮部和髓，仅留下其木质部，切成小段后用电动粉碎机粉碎成粉末并过40目筛孔。用匀质缓冲液清洗樟子松粉末2次，再分别用80%丙酮清洗2次和纯丙酮清洗1次。每次清洗都采用12 000 r/min离心15 min，弃去清洗液，留沉淀。纯丙酮清洗后沉淀在45℃烘干备用。

1.2.2.2 巯基乙酸和盐酸处理樟子松粉末

清洗后的樟子松粉末巯基乙酸和盐酸处理，同上述棉花样品中的巯基乙酸和盐酸处理。

1.2.3 样品的扫描电子显微镜观察

分别取切碎的棉花纤维、巯基乙酸和盐酸处理棉花纤维、粉碎的樟子松粉末、巯基乙酸和盐酸处理后的樟子松粉末各少量，用导电性能好的导电双面胶将样品粘在金属样品台面上，置于真空蒸发器内，喷镀100～200 Å的金膜，利用扫描电镜观察并拍照。

1.2.4 样品的FTIR检测

将45℃烘干至恒重的粉状样品均匀的平铺于傅立叶变换红外光谱仪(Nicolet iS10 FTIR)的金刚石检测窗口，旋转压力旋钮直到指示的压力，保证样品与测试面窗口紧密接触，并将红外光束的损失降至最低。测试时环境条件：相对湿度为(65±2)%，温度为(24±1)℃。样品的FTIR光谱是由本仪器所装备的Smart iTR Basic获得，记录每个样品在1 800～800 cm光谱范围内扫描32次光谱的平均值。在做样品之前须做空白干净金刚石的背景扫描。所有获得的光谱数据均用Nicolet iS10 FTIR光谱仪所配备的软件OMNIC做基线校正和均一化处理，然后计算光谱差值。

1.3 数据处理

用Excel 2010处理数据，GraphPad Prism8进行统计分析并作图。

2 结果与分析

2.1 化学预处理后样品细胞壁结构的变化

研究表明，样品会影响其细胞壁的FTIR检测分析结果。而用巯基乙酸和盐酸处理的棉花纤维样品表现为纤维断裂，次生壁暴露，甚至纤维细胞次生壁的日生长轮依稀可辨。用电动粉碎机粉碎的樟子松枝条样品在扫描电镜下呈条块状，而用巯基乙酸和盐酸处理后的样品表现为块状样品进一步分离成片状，细胞壁的结构进一步破碎。图1

2.2 化学预处理后FTIR测试光谱的变化

研究表明，2种处理的棉花纤维光谱值在1 800～800 cm-1的波数范围内存在差异，该区域包括不同的官能团，特别是碳水化合物指纹区(1 180～950 cm-1)、木质素(1 510 cm-1)、愈创木基(1 270 cm-1)、丁香基(1 310 cm-1)、酚酯(1 730 cm-1)和酰胺(1 550、1 650 cm-1)。处理过的棉花纤维在1 730 cm-1，1 350～1 150 cm-1波数区间吸光度值高于切碎的棉花纤维。初生壁影响了棉花纤维细胞壁结构组分检测的准确性，FTIR扫描检测细胞壁的深度是有限的。樟子松枝条苯丙烷类化合物含量较高，粉碎的樟子松枝条在1 500～1 100 cm-1波数区间已表现出较多的吸收峰，巯基乙酸和盐酸处理过的樟子松枝样品表现出更丰富的吸收波峰，用巯基乙酸和盐酸处理过的樟子松枝条的吸收光谱减去切碎的樟子松枝条的吸收光谱可显示巯基乙酸和盐酸处理所揭示的组分光谱。图2，图3

巯基乙酸和盐酸处理棉花纤维的FTIR光谱吸光度值在1 800～1 650 cm-1的波谱区间内显著高于原始切碎棉花纤维，在1 800～1 550 cm-1的波谱区间内，2种处理棉花纤维的光谱间存在极显著差异；1 320～1 200 cm-1波谱内，巯基乙酸和盐酸处理棉花纤维的FTIR光谱吸光度值显著高于原始切碎棉花纤维，2种处理的光谱间存在显著差异；巯基乙酸和盐酸处理可以成功地打破棉花纤维的次生细胞壁，可以用FTIR光谱研究棉花纤维次生细胞壁的结构组分。图4，图5

研究表明，在1 540～1 100 cm-1的波谱区间内，巯基乙酸和盐酸处理樟子松枝条粉末的FTIR光谱吸光度值显著高于粉碎的樟子松枝条粉末，两者间存在极显著差异，巯基乙酸和盐酸处理可以打破植物的次生细胞壁，植物材料经过该处理后可以用FTIR光谱研究植物次生细胞壁的组成。图6

3 讨 论

傅立叶近红外光谱(FTIR)是一种分析植物细胞壁的常用方法，该方法的优点包括：可简单快速分析植物细胞壁的组分；需要的样品量小；可以不必破坏结构而鉴别大分子和功能组分，并提供丰富的结构组分信息；可以鉴别细胞壁组分由不同的因子(如生长和发育过程，变异，生物或非生物逆境等)而引起的变化，并由此推测细胞壁的交联结构；可与显微镜和其它分析方法相结合鉴别细胞不同器官和组织的非均一性结构[13,14]。该方法也有其局限性。例如，所分析的细胞壁样品需磨成粉状，以利于细胞壁结构充分暴露在FTIR测试窗口，而有些植物细胞壁样品是很难磨成粉状的，如植物纤维类样品，典型代表有棉花纤维，棉花纤维是单细胞结构，虽然只有11～22 mm的直径，其表层由0.2 μm的初生壁包被[15,16]，柔软、纤细和不规则天然扭曲等特殊性使得其即便是用反复切割所产生的类似粉状的样品进行FTIR检测，也影响其棉花纤维细胞壁结构组分检测的准确性。研究中扫描电镜和FTIR分析结果也表明了这一处理的局限性。

注：A.切碎的棉花纤维；B.巯基乙酸和盐酸处理并清洗过的棉花纤维；C.粉碎的樟子松枝条粉末；D.巯基乙酸和盐酸处理并清洗过的樟子松枝条粉末

注：Gh_0.切碎的棉花纤维；Gh_b.巯基乙酸和盐酸处理并清洗过的棉花纤维；Gh_b-0.用巯基乙酸和盐酸棉花纤维的吸收光谱减去切碎的棉花纤维的吸收光谱

注：Pi_0.粉碎的樟子松粉末；Pi_b.巯基乙酸和盐酸处理并清洗过的樟子松粉末；Pi_b-0.用巯基乙酸和盐酸樟子松粉末的吸收光谱减去切碎的樟子松粉末的吸收光谱

注：A.切碎棉花纤维(Gh_0)和巯基乙酸和盐酸处理的棉花纤维(Gh_b) 1 800～1 550 cm-1的光谱(n=30)；B.光谱值小提琴图: 显示数据分布，****表示极显著差异

A.切碎棉花纤维(Gh_0)和巯基乙酸和盐酸处理的棉花纤维(Gh_b) 1 320～1 200 cm-1的光谱(n=30)；B.光谱值小提琴图: 显示数据分布，****表示极显著差异

巯基乙酸法在分析植物细胞壁中苯丙烷类化合物含量时，酸性加热的条件下，巯基乙酸中的巯基与细胞壁中的苯丙烷类化合物中的苯羟基形成酯键化合物，该化合物可溶于碱性溶液，可以利用纯碱提取以达到定量测试的目的[11]。巯基乙酸和盐酸处理植物细胞壁形成的酯键化合物，导致细胞壁间相互交联的化学键断裂，植物细胞壁断裂破碎，次生壁暴露，可以克服植物纤维类样品难以磨成粉状的缺点。植物细胞壁经巯基乙酸和盐酸处理后再利用FTIR的方法检测植物细胞壁

A.粉碎樟子松(Pi_0)(n=12)和巯基乙酸和盐酸处理的樟子松(Pi_b) 1 540～1 100 cm-1的光谱(n=9)；B.光谱值小提琴图: 显示数据分布，**表示显著差异

时，可检测到非处理时所检测不到的组分，也克服了植物纤维类样品难以磨成粉状而无法直接应用FTIR观测的限制。近红外吸收光谱查阅表明巯基乙酸中的巯基光谱吸收很微弱，其光谱吸收值在2 560 cm-1，一般不会影响光谱的解析。巯基乙酸中含有酮基，饱和开放酮基吸收光谱区间在1 725～1 705 cm-1，试验设计包括将处理后的样品用蒸馏水清洗3次，以清除游离试剂对实验结果的影响。该化学预处理方法能有效的打碎纤维样品，克服了棉花纤维样品难以磨碎的问题，根据其巯基结合的部位在细胞壁中的苯羟基，也是其打碎样品的部位，可真实反映植物细胞壁的组织结构，采用FTIR观察时能揭示非处理时所观察不到的组分，这样有利于FTIR观察揭示细胞壁中苯丙烷类化合物的组分，也为特殊材料的结构组分分析提供了技术思路。在该方法创立的过程中，选择了木质化程度较高、苯丙烷类化合物含量较高的樟子松枝条为木质化程度和硬度较高材料的代表，对处理方法进行了验证。樟子松枝样品为苯丙烷类化合物含量较高的可直接粉碎样品，FTIR直接分析发现粉碎的樟子松枝条在1 500～1 100 cm-1波峰区间已表现出较多的吸收峰，可以直接获得其组分分析结果，但利用巯基乙酸和盐酸处理后，再采用FTIR分析，结果发现样品更加破碎，含有羟基苯的结构组分更加暴露，巯基乙酸处理后的樟子松枝样品表现出更丰富的吸收波峰，显示了一些非化学预处理所观察不到的吸收波峰，使FTIR分析得到的组分结果更加丰富，验证了该方法的可行性和有效性。

4 结 论

4.1巯基乙酸和盐酸处理可以充分将样品结构进一步破碎，细胞壁结构的表面可以充分暴露在FTIR测试扫描窗口，保证了FTIR检测的准确性，体现了巯基乙酸和盐酸处理的有效性。

4.2化学预处理的棉花纤维光谱值在1 800～800 cm-1的波数范围内与原始切碎的棉花纤维存在差异，尤其在1 800～1 650 cm-1的波谱区间内显著高于原始切碎棉花纤维，在1 800～1 550 cm-1的波谱区间内，2种处理棉花纤维的光谱间存在极显著差异；在1 320～1 200 cm-1波谱内，巯基乙酸和盐酸处理棉花纤维的FTIR光谱吸光度值显著高于原始切碎棉花纤维，2种处理的光谱间存在显著差异。利用巯基乙酸和盐酸对棉花纤维细胞壁样品进行预处理，该化学预处理方法能有效的打碎纤维样品，克服了纤维样品难以磨碎的问题，再利用FTIR进行光谱分析，实现了应用FTIR分析细胞壁的真实结构组分。