牙龈卟啉单胞菌来源的脂多糖通过X盒结合蛋白1调控脂肪细胞胰岛素信号通路的机制研究

陆佳艺伍倩琪陈伊燕叶蕾蕾苏媛，

1.南方医科大学顺德医院（佛山市顺德区第一人民医院）口腔中心，顺德528300；

2.南方医科大学口腔医院牙周科，广州510280

牙周炎是口腔中常见的慢性炎症性疾病，主要表现为牙齿周围软硬组织的炎性破坏[1]。研究发现，牙周炎对2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发生发展具有促进作用[2-3]，但具体机制尚不清楚。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周炎的主要致病菌，其外膜蛋白脂多糖（lipopolysaccharid，LPS）是主要毒力因子。牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharid，P.gingivalis-LPS）通过破溃的牙周组织进入血循环到达远隔器官，影响机体的糖代谢水平[4-5]。而作为糖代谢的重要靶组织脂肪组织，是否受牙周炎的影响目前尚未证实。

近年来，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的关键信号分子X盒结合蛋白1（Xbox binding protein 1，XBP1）被证实可受P.gingivalis-LPS的调控[6]，而XBP1同时又参与胰岛素信号通路的传导[7-8]。因此，XBP1有望成为P.gingivalis-LPS调控大鼠脂肪细胞胰岛素信号的关键靶点。本实验通过体外构建pLVX-XBP1载体、p-LVX-XBP1-RNAi载体分别转染到大鼠原代脂肪细胞中，采用P.gingivalis-LPS刺激转染后的细胞，验证XBP1能否调控大鼠脂肪细胞胰岛素信号通路关键蛋白胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）-1、下游磷脂酰肌醇依赖性激酶（phosphoinositide dependent protein kinase，PDK）-1和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），又称AKT的表达。

1 材料和方法

1.1 材料

4～5周雄性SD大鼠（南方医科大学动物实验中心），杜氏培养液（Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12，DMEM/F12）、胎牛血清（Gibco公司，美国），油红O试剂盒（南京建成生物工程研究所），多聚赖氨酸（Sigma公司，美国），P.gingivalis-LPS（InvivoGen公司，美国），pLVX-XBP1慢病毒、pLVX-XBP1-RNAi慢病毒、逆转录试剂盒、实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒（重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司），ab245314型IRS-1抗体（Abcam公司，美国），3848T型p-PDK-1抗体、4060T型p-AKT抗体（CST公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 分离培养原代大鼠脂肪细胞 断颈处死SD大鼠后，在无菌条件下剪开大鼠腹部皮毛，取附睾脂肪组织，采用眼科剪将脂肪组织剪成0.5～1.0 mm大小的均匀颗粒，采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化液在37℃条件下消化脂肪组织，每隔5 min手动振荡30 s以促进消化，消化时间为60 min，直到脂肪组织被消化成乳糜液样液体。将消化后的乳糜样液体加入4 mL PBS，轻轻吹打混匀，通过200目孔径的不锈钢细胞筛过滤，滤液转移入离心管中，向离心管中加入10 mL PBS洗细胞3次。以250g·min-1的转速离心5 min，用吸管吸出上清液，加入另一试管中，加入PBS 10 mL洗细胞，再次离心、去除下清液，重复此步骤2次。再用10 mL含20%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液洗涤并重悬细胞，调整密度为2×106个·mL-1，取50μL加入每孔2 mL的培养液的6孔板中，盖以20 mm×20 mm多聚赖氨酸处理过的无菌盖玻片，放37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2 油红O鉴定原代大鼠脂肪细胞 用油红O固定液固定原代大鼠脂肪细胞10～15 min，吸出固定液后，放于流通的空气中10～15 min，加入新配制好的油红O染色剂浸染15 min；吸出染色液，加入60%异丙醇漂洗20～30 s，流水冲洗，蒸馏水稍微清洗；吸出蒸馏水，加入苏木素染色液，复染核2 min；去除苏木素染色液，流水冲洗，晾干；200倍倒置光学显微镜观察拍照。

1.2.3 蛋白质印迹（Western Bolt）检测P.gingivalis-LPS刺激脂肪细胞后IRS-1、磷酸化PDK-1（p-PDK-1）、磷酸化AKT（p-AKT）的表达 将培养48 h的脂肪细胞接种于6 cm培养皿24 h后，分为空白对照组和刺激组，空白对照组为100 ng·mL-1P.gingivalis-LPS刺激的大鼠脂肪细胞0 h；刺激组为100 ng·mL-1P.gingivalis-LPS分别刺激大鼠脂肪细胞4、8、12、24 h。刺激后提取细胞总蛋白，用BCA蛋白质定量法检测总蛋白浓度，每个上样孔等量蛋白（20μg）通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，10%脱脂牛奶摇床封闭1 h；将含有目的蛋白IRS-1、p-PDK-1、p-AKT和内参蛋白β肌动蛋白（β-actin）的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）放于相应的抗体中，4℃孵育过夜；用含Tween 20的Tris缓冲盐水（Tris buffered saline with Tween 20，TBST）漂洗后，加入辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G二抗室温孵育1 h。TBST漂洗，化学发光显影并拍照。用Image J图像分析软件对各组条带行灰度值分析，以β-actin作为内参，目的蛋白与内参蛋白的灰度比值为IRS-1、p-PDK-1、p-AKT蛋白表达的相对表达水平。

1.2.4 RT-qPCR检测过表达、干扰XBP1慢病毒载体转染的脂肪细胞 过表达XBP1慢病毒载体pLVX-XBP1、干扰XBP1慢病毒载体pLVX-XBP1-RNAi由重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司构建。实验分为空白对照组、空载过表达慢病毒（pLVX-NC1）、过表达XBP1慢病毒（pLVX-XBP1）、空载干扰慢病毒（pLVX-NC2）、干扰XBP1慢病毒（pLVX-XBP1-RNAi）。

将pLVX-NC1、p-LVX-XBP1、pLVX-NC2、pLVX-XBP1-RNAi分别转染到大鼠原代脂肪细胞后，分别接种于6 cm培养皿24 h后，用TRIzol法分别提取5个实验组细胞的总RNA，并测定RNA浓度和纯度。用逆转录试剂盒将RNA逆转录成互补DNA，RT-qPCR检测转染后的脂肪细胞内XBP1的mRNA表达水平。

XBP1引物序列：上游AAAGAAAGCCCGGATGAGC，下游ATTCATCCCCAAGCGTGTCC。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列：上游AGTGCCAGCCTCGTCTCATA，下游GAGAAGGCAGCCCTGGTAAC。扩增条件均为95℃30 s；然后反复95℃5 s，60℃30 s循环40次。以2-ΔΔCT公式法计算目的基因XBP1的mRNA相对表达水平。

1.2.5 Western Bolt检测在过表达XBP1、干扰XBP1慢病毒转染脂肪细胞后P.gingivalis-LPS刺激下IRS-1、p-PDK-1、p-AKT的表达 本实验采用以下4组：pLVX-NC1、pLVX-XBP1、pLVX-NC2、pLVX-XBP1-RNAi分别转染大鼠原代脂肪细胞，分别接种于6 cm培养皿24 h，通过100 ng·mL-1P.gingivalis-LPS刺激转染后的大鼠脂肪细胞4、8、12、24 h，用BCA法检测蛋白浓度。

每个上样孔皆取等量蛋白（20μg）通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，10%脱脂牛奶摇床封闭1 h。将含有目的蛋白IRS-1、p-PDK-1、p-AKT和内参蛋白β-actin的PVDF膜放于相应的抗体中，4℃孵育过夜。TBST漂洗后，加入辣根过氧化物酶标记的IgG二抗室温孵育1 h。TBST漂洗，化学发光显影并拍照。用Image J图像分析软件对各组条带行灰度值分析，以β-actin作为内参，目的蛋白与内参蛋白的灰度比值为IRS-1、p-PDK-1、p-AKT蛋白表达相对表达水平。

1.3 统计学分析

实验数据用GraphPad Prism 7软件进行分析，实验数据以均数±标准差表示，两组间单因素比较采用t检验，组间双因素比较采用双因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。研究数据均来自3次或3次以上独立实验。

2 结果

2.1 大鼠脂肪细胞原代分离培养以及油红O鉴定脂肪细胞

原代细胞培养的形态观察显示，细胞贴壁后为类圆形如图1所示。培养2周后，胞内出现脂肪颗粒积聚，经过油红O染色，确定细胞分化成为脂肪细胞如图2所示。

图1 原代培养的大鼠脂肪细胞 倒置光学显微镜 ×200Fig 1 Primary cultured rat adipocytes inverted optical microscope ×200

图2 油红O染色鉴定原代大鼠脂肪细胞 ×200Fig 2 Primary rat adipocytes were identified by red staining O×200

2.2 Western Bolt检测P.gingivalis-LPS刺激脂肪细胞后胰岛素信号通路蛋白表达结果

Western Bolt检测P.gingivalis-LPS刺激脂肪细胞0、4、8、12、24 h后，胰岛素信号通路IRS-1、p-PDK-1、p-AKT的蛋白表达如图3A所示，图3B～D所示刺激4、8、12、24 h后，IRS-1、p-AKT、p-PDK-1蛋白表达与空白对照组0 h相比呈明显下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。统计结果表明，脂肪细胞在P.gingivalis-LPS刺激下，胰岛素信号通路蛋白IRS-1、PDK-1、AKT受抑制，随着刺激时间的推移，IRS-1、p-PDK-1、p-AKT蛋白的表达呈下降趋势。

图3 Western Bolt检测P.gingivalis-LPS刺激脂肪细胞后IRS-1、p-PDK-1、p-AKT的蛋白表达结果Fig 3 Western Bolt detected theprotein expression of adipocytes IRS-1，p-PDK-1 and p-AKT after stimulated by P.gingivalis-LPS

2.3 RT-qPCR检测过表达、干扰XBP1慢病毒载体转染脂肪细胞结果

结果如图4所示，pLVX-XBP1组XBP1 mRNA相对表达量为2.06±0.01，与pLVX-NC1组（1.03±0.01）相比明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；pLVX-XBP1-RNAi组XBP1 mRNA相对表达量为0.53±0.03，与pLVX-NC2组（1.12±0.1）相比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。综上，p-LVX-XBP1、pLVX-XBP1-RNAi成功构建。

图4 qRT-PCR检测慢病毒转染脂肪细胞结果Fig 4 qRT-PCR detected the transfection results of lentivirus into adipocytes

2.4 Western Bolt检测在pLVX-XBP1、pLVX-XBP-1-RNAi转染脂肪细胞后P.gingivalis-LPS刺激下胰岛素信号通路的表达

pLVX-XBP1转染脂肪细胞后，Western Bolt检测胰岛素信号通路IRS-1、p-PDK-1、p-AKT的蛋白表达如图5A所示，图5B～E所示，P.gingivalis-LPS刺激4 h后，pLVX-XBP1组IRS-1的蛋白表达明显高于pLVX-NC1组，差异有统计学意义（P＜0.05）；pLVX-XBP1组p-PDK-1的蛋白表达略低于pLVX-NC1组，差异无统计学意义；pLVX-XBP1组p-AKT的蛋白表达明显低于pLVX-NC1组，差异有统计学意义（P＜0.05）。刺激8、12 h后，pLVX-XBP1组IRS-1、p-PDK-1、p-AKT的蛋白表达明显高于pLVX-NC1组，差异有统计学意义（P＜0.05）。刺激24 h后，pLVX-XBP1组IRS-1的蛋白表达明显高于pLVX-NC1组，差异有统计学意义（P＜0.05）；pLVX-XBP1组p-PDK-1、p-AKT的蛋白表达明显低于pLVX-NC1组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图5 Western Bolt检测pLVX-XBP1转染脂肪细胞后P.gingivalis-LPS刺激下IRS-1、p-PDK-1、p-AKT的蛋白表达结果Fig 5 Western Bolt detected theexpression of protein IRS-1，p-PDK-1 and p-AKT，stimulated by P.gingivalis-LPSafter pLVX-XBP1 transfecting adipocytes

pLVX-XBP1-RNAi转染脂肪细胞后，Western Bolt法检测胰岛素信号通路IRS-1、p-PDK-1、p-AKT的蛋白表达如图6A所示，如图6B～E所示，P.gingivalis-LPS刺激4、8、12、24 h后，pLVXXBP1-RNAi组IRS-1、p-PDK-1、p-AKT的蛋白表达皆明显低于pLVX-NC2组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图6 Western Bolt检测pLVX-XBP1-RNAi转染脂肪细胞后P.gingivalis-LPS刺激下IRS-1、p-PDK-1、p-AKT的蛋白表达结果Fig 6 Western Bolt detected the expression of protein IRS-1，p-PDK-1 and p-AKT，stimulated by P.gingivalis-LPSafter pLVX-XBP1-RNAi transfecting adipocytes

3 讨论

流行病学调查[9]显示，牙周炎的严重程度与T2DM的糖代谢水平相关。在临床上，牙周基础治疗能降低糖化血红蛋白和空腹血糖，改善患者的糖代谢水平[10]。因此，牙周炎对T2DM的影响意义重大，是目前交叉学科领域的研究热点之一。

T2DM的重要病理机制是胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），它是指肝脏、脂肪和骨骼肌等胰岛素靶组织对胰岛素敏感性下降，胰岛素信号传导受阻，造成糖代谢异常[11]。其中，脂肪组织胰岛素信号受阻对全身糖代谢水平有重要影响[12]，是诱导机体发生IR的起始[13]。研究[14]发现，牙周炎可引起大鼠内脏脂肪组织发生炎症性改变，并且这种改变与机体的IR高度相关。但牙周炎能否造成脂肪组织胰岛素信号通路的改变，目前尚未见报道。本研究发现，牙周炎的主要毒力因子P.gingivalis-LPS可造成脂肪细胞IRS-1蛋白表达降低，初步揭示了牙周炎可调控脂肪细胞的胰岛素信号。胰岛素通过与靶细胞表面的胰岛素受体相结合激活IRS，调控下游信号转导。IRS-1是IRS家族中的重要成员，对胰岛素信号起关键调节作用。IRS-1的激活进一步促进下游PDK-1和AKT的磷酸化，从而促进葡萄糖转运，糖原合成等多种生物学效应。因此，IRS-1、PDK-1、AKT通路作为一条经典的糖代谢通路被广泛关注。本研究中，P.gingivalis-LPS刺激大鼠脂肪细胞后，IRS-1的蛋白表达减少，其下游的PDK-1和AKT磷酸化水平降低，说明P.gingivalis-LPS可抑制大鼠脂肪细胞中的IRS-1、PDK-1、AKT信号通路。

本研究旨在揭示P.gingivalis-LPS通过何种机制调控脂肪细胞IRS-1信号通路，结果显示，ERS相关信号分子XBP1是P.gingivalis-LPS调控IRS-1信号通路的关键靶点。ERS是真核细胞的一种保护性应激反应，细胞受外界刺激发生ERS时，位于内质网腔内的分子伴侣蛋白-结合免疫球蛋白（binding immunoglobulin protein，BiP）与内质网的3种跨膜蛋白解离并主动结合到未折叠或错误折叠蛋白，激活内质网跨膜蛋白并启动3条信号通路：肌醇需要酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）、双链RNA依赖的蛋白激酶R样内质网激酶（PKR like-ER-resident kinase，PERK）和活化转录因子6（activating transcriptionfactor 6，ATF-6）。近年来研究表明，ERS在IR的发生发展中扮演重要作用，而XBP1是其中的关键信号分子。XBP1的活化可促进脂联素的多聚化，改善肥胖小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。这与本实验结果相一致，抑制XBP1的脂肪细胞在P.gingivalis-LPS刺激后，IRS-1、PDK-1和AKT表达明显下降，胰岛素信号通路表达受阻，胰岛素敏感性降低；过表达XBP1的脂肪细胞在P.gingivalis-LPS刺激后，IRS-1的表达升高，说明上调XBP1能改善IRS-1的蛋白表达；P.gingivalis-LPS刺激8、12 h后，PDK-1和AKT表达升高，但24 h后明显下降，初步分析调控PDK-1和AKT信号通路的上游较为复杂，可能受XBP1以外的其他信号通路的影响，具体机制还有待进一步探索。因此，本研究证实XBP1是介导牙周炎调控脂肪组织IRS-1信号通路的关键靶点。

综上，P.gingivalis-LPS刺激大鼠脂肪细胞后，胰岛素信号通路IRS-1/PDK-1/AKT的表达随时间推移呈下降趋势。过表达XBP1的脂肪细胞，IRS-1、PDK-1、AKT的蛋白表达水平得到改善；而抑制XBP1的脂肪细胞，IRS-1、PDK-1、AKT的蛋白表达受阻。本研究通过体外模型证实，牙周毒力因子P.gingivalis-LPS可通过XBP1调控脂肪细胞IRS-1、PDK-1、AKT信号通路。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。