miR-142-3P靶向ADAM17对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞活性的影响及其作用机制研究①

张 超，梁 舒，郭占非，左淑飞，范文强

(新乡医学院第四临床学院、新乡市中心医院风湿免疫科，河南 新乡 453000)

类风湿性关节炎(RA)是临床常见自身免疫性疾病，主要病理特征为炎性细胞浸润、新生血管形成血管翳、关节滑膜细胞增生、软骨和骨结构破坏，主要临床常表现为关节肿胀、麻木、变形、僵硬、足跛难行，严重者会致使关节畸形、骨强直、残疾，甚至是功能丧失[1,2]。全球类风湿性关节炎人数占总人口的1.00%，成年人患病率高达2～4/10000，我国类风湿性关节炎患病人数高达540万，患病率为0.5%，年龄越大，患病率越高，在60岁以上人群中，患病率高达40.00%，严重影响患者生命质量。成纤维样滑膜细胞(FLS)是导致骨关节破坏、滑膜组织增生的主要效应细胞，在RA患者发病过程中，FLS呈“瘤样增生”、异常活化状态，因此，对FLS的活性状态研究具有重要意义[3]。在RA患者中，微小R-142-3P(miR-142-3P)呈升高状态，而解聚素金属蛋白酶17(ADAM17)与miR-142-3P由靶向关系[4]，故本研究旨在观察miR-142-3P靶向ADAM17对RA-FLS活性的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

10%胎牛血清(上海联硕生物科技有限公司)，2.5g/L胰蛋白酶、DMEM培养基、RPMI 1640培养基(北京泽平科技有限责任公司)，100U/mL青链霉素双抗(浙江羽翔生物科技有限公司)，RIPA裂解液、PVDF膜、TBST、Lipofectamine2000(北京伊塔生物科技有限公司)，50g/L脱脂奶粉(北京百奥莱博科技有限公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。

1.2 细胞来源及培养

于中科院上海细胞库购买RA-FLS、12份类风湿关节炎-外周血单个核细胞(RA-PBMC)、3分正常人外周血单个核细胞(PBMC)，12份类风湿关节炎-外周血单个核细胞(RA-PBMC)，随机分为4个RA-PBMC组，每组3份，3份正常人外周血单个核细胞(PBMC)记为正常PBMC组，RA-FLS采用DMEM培养基培养，该培养基含有10%胎牛血清，RA-PBMC、PBMC采用RPMI 1640培养基培养，该培养基含有100U/mL青链霉素双抗及10%胎牛血清，均放于5%CO2的培养箱培养，温度为37℃，培养过程采用显微镜观察细胞生长情况，生长至密度达80%，给予2.5g/L胰蛋白酶消化，给予其传代。

1.3 检测靶向解聚素金属蛋白酶17(ADAM17)和微小R-142-3P(miR-142-3P)表达情况

(1)选择1组RA-PBMC及1组正常PBMC， 采用Western blot法检测检查ADAM17表达情况，细胞总蛋白采用RIPA裂解液提取，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将分离的蛋白转移至PVDF膜，给予50g/L脱脂奶粉封闭，封闭温度为常温，封闭1h，封闭完成后加入一抗，孵育过夜，孵育温度为4℃，再给予TBST洗涤3次，每次洗涤10min，加入二抗，孵育1h，孵育温度为常温，再给予TBST洗涤3次，每次洗涤10min，化学发光液显色，以β-actin为内参，采用光密度分析法计算蛋白表达情况。采用实时荧光定量PCR检测miR-142-3P ，采用Trizol试剂提取RA-PBMC、正常PBMC中总RNA水平，并合成cDNA，以此为模板进行PCR测定，严格按照时荧光定量PCR试剂盒说明书操作，以U6为内参，计算miR-142-3P 表达水平，算法为2-ΔΔCt 。

1.4 过度表达ADAM17和miR-142-3P的RA-PBMC对RA-FLS凋亡及增殖的影响

将3组RA-PBMC随机分为空白对照组、过度ADAM17组、过度miR-142-3P组，每组3个，RA-FLS接种于Transwell小室下室，将RA-PBMC接种于Transwell小室上室，给予Lipofectamine2000转染相应质粒，收集RA-FLS，检测细胞增殖活性和凋亡情况。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 RA-PBMC组、正常PBMC组中ADAM17和miR-142-3P表达情况比较

RA-PBMC组中ADAM17水平低于正常PBMC组，RA-PBMC组中miR-142-3P水平高于正常PBMC组(P<0.05)，见表1 。

表1 RA-PBMC组、正常PBMC组中ADAM17和miR-142-3P表达情况

2.2 RA-FLS凋亡率、增殖活性比较

过度miR-142-3P组RA-FLS凋亡率高于空白对照组(P<0.05)，RA-FLS增殖活性低于空白对照组(P<0.05)；过度ADAM17组RA-FLS凋亡率低于空白对照组，RA-FLS增殖活性高于空白对照组(P<0.05)，见表2 。

表2 3组RA-FLS凋亡率、增殖活性比较

3 讨论

RA是临床常见疑难病之一，环境、性激素、遗传、微生物感染等均是RA诱发因素[5]。RA是以滑膜病变为特征的自身免疫性疾病，滑膜病变主要为炎性细胞浸润、骨组织损伤、血管翳形成、侵蚀性软骨、滑膜增生，伴随不可逆性、进行性关节破坏、畸形及功能丧失[6]。滑膜细胞由巨噬细胞及FLS组成，其中FLS是滑膜细胞的主要成分，对滑膜细胞的活性、迁移、凋亡等具有影响作用[7]。miRNA是一种内源性非编码RNA，参与细胞的生长、增殖、分化等，在RA的发展中具有重要作用，其miR-142-3P高表达于系统性硬化症，参与自身免疫性疾病的发生及发展，与类风湿因子水平呈正相关，在RA中发挥重要作用[8]。ADAM17是一种转换酶，可通过裂解各种跨膜蛋白及其受体调控基因表达，还可释放生物活性因子、活化配体，是抵御感染、伤害的第一道防线，在免疫系统中发挥重要作用。研究发现，miR-142-3P与ADAM17有靶向调控作用，可调控FLS活性[4]。为进一步了解影响RA-FLS活性因素，本次研究旨在观察miR-142-3P靶向ADAM17对RA-FLS活性的影响。

本研究对正常PBMC及RA-PBMC中miR-142-3P、ADAM17表达进行检验，发展RA-PBMC组中ADAM17水平低于正常PBMC组，RA-PBMC组中miR-142-3P水平高于正常PBMC组，说明RA-PBMC中ADAM17呈低表达状态，miR-142-3P呈高表达状态。进一步观察miR-142-3P、ADAM17对RA-FLS活性及凋亡的影响，发现过度miR-142-3P组RA-FLS凋亡率高于空白对照组，RA-FLS增殖活性低于空白对照组；过度ADAM17组RA-FLS凋亡率低于空白对照组，RA-FLS增殖活性高于空白对照组，说明miR-142-3P与RA-FLS活性呈负相关，ADAM17与RA-FLS活性呈正相关。

综上所述，RA-PBMC中ADAM17呈低表达状态，miR-142-3P呈高表达状态，miR-142-3P与RA-FLS活性呈负相关，ADAM17与RA-FLS活性呈正相关。