IL20RB、ATP6V0A1和STX10基因对PRRSV和PEDV的增殖作用

王金玉，上官爱哨，孙玉梅，蒋金河，刘忠柱，张淑君

华中农业大学动物科学技术学院与动物医学院，武汉 430070

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus，PRRSV）感染而引起的严重病毒性传染病。猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染引起的猪肠道病毒性疾病。这2种疾病都具有高发病率、高死亡率、能感染任何年龄及生产阶段的猪的特点，特别是免疫系统发育不完全和抵抗力较弱的哺乳期仔猪极易感染，尤其是PEDV 导致的发病率可高达70%以上，发病猪的死亡率可达90%以上［1-2］。近年来，随着生物信息学和基因编辑技术的发展，人们对病毒（如PRV、PRRSV 等）感染相关基因进行了筛选和功能研究。笔者所在实验室利用全基因组基因敲除的猪源gRNA 文库筛选出55 个与PRRSV 感染相关的候选基因，根据筛选过程中打分和排序及功能，从这55 个候选基因中选择3 个基因（IL20RB、ATP6V0A1和STX10），进一步探讨其功能。前人研究发现，IL20RB参与IL-20 受体合成，可能影响病毒与宿主免疫系统的互作［3］；ATP6V0A1和STX10参与胞内运输，可能影响病毒的合成和释放［4］；IL-20RB基因编码的IL20RB 链和IL20RA 共同组成白细胞介素-20 受体I 复合物（IL-20-RI），参与一些慢性炎症和自身免疫性疾病的调控［5］；细胞因子IL-10、IL-20 和IL-24 均参与调控IL20RB 形成的IL-20-RI传输信号［6］；IL20RB 是宿主免疫系统的一部分，可能会成为病毒及其他病原攻击的潜在靶点［7］。ATP6V0A1基因编码的ATP6V0A 蛋白参与维持细胞内酸碱平衡和胞内运输［8］；现有研究表明ATP6V0A1促进内体的成熟，V 型ATP 酶和相关蛋白可能在不同的胞内运输中发挥调控作用［9］；而ATP6V0A1的表达可能也会影响自噬体进而影响病毒粒子在胞内的运输及释放过程［10］。STX10基因编码的突触融合蛋白10（Syntaxin-10）在突触泡停靠到突触前膜、释放递质的过程中起作用，也参与胞内的运输过程［11］；STX10与STX16等基因共同介导晚期溶酶体与高尔基体的互作和自噬过程，在细胞凋亡过程中发挥作用［12］。然而，这3 个基因对PRRSV 和PEDV 增殖的作用还不清楚，故本研究利用CRISPR/Cas9 基因敲除技术对实验室前期构建的猪源细胞分别敲除这3 个基因，探讨该基因敲除和功能缺失对PRRSV 和PEDV 增殖的影响，以明确这3 个基因在PRRSV 和PEDV 增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及细胞

质粒PLH-sgRNA1-hygb、pMD2.G 和psPAX2，以及Marc145 细胞、WUH3 PRRSV 毒株（GenBank Accession No.：HM853673）、PEDV YN145 毒株（GenBank Accession No.：KT02123）均由华中农业大学何启盖教授馈赠。猪肾PK15-CD163-Cas9 细胞和猪小肠上皮细胞（IPEC-J2-Cas9 细胞）均为笔者所在实验室前期研究中制备，其中，PK15-CD163-Cas9是在猪肾PK15 细胞中转入PRRSV 受体CD163 和核酸酶Cas9基因，使该细胞既可感染PRRSV又可用于敲除基因；IPEC-J2-Cas9 是在猪小肠上皮细胞（IPEC-J2 细胞）中转入核酸酶Cas9基因，使该细胞既可感染PEDV又可用于基因敲除。

1.2 试 剂

无内毒素质粒小提中量试剂盒、细胞基因组DNA提取试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR扩增试剂和Marker均购于Tiangen公司，Neofect、反转录试剂盒和RNAex均购于AG公司，simply P总RNA 提取试剂盒购于Bio-Flux 公司，定量PCR 所需荧光染料购于Biomed 公司，琼脂糖购于普博欣生物公司，Dul Red 核酸染料购于Fanbo 公司，50 × TAE 购于谷歌生物有限公司，DH5α 感受态购于全式金公司，DMEM 购于Hyclone 公司，FBS 购于Gibico 公司，BbsⅠ限制性内切酶和T4连接酶为Thermo Fisher公司产品。

1.3 gRNA 的设计、Cas9-gRNA 载体的构建和转化

根据Genbank 中ATP6V0A1（Gene ID：100523018）、IL20RB（Gene ID：100620875）和STX10（Gene ID：100627609）基因的序列，从笔者所在实验室前期筛选所设计的全基因组基因敲除gRNA文库中选出每个基因有效敲除的gRNA 各1条，并根据所用限制酶的酶切位点，合成带有粘性末端的gRNA（表1）。

表1 3个基因分别被敲除的gRNA及其与表达载体连接的粘性末端序列Table 1 The gRNA of knocked three genes and sticky end sequences connected expression vector

1.4 重组慢病毒质粒的构建

用T4 DNA 连接酶将引物二聚体连接到用BbsⅠ限制性核酸内切酶酶切后的PLH-sgRNA1-hygb 载体上，4 ℃连接培养12 h，转入DH5α 感受态中。将得到的单菌落稀释在50 μL 培养液中，取其中10 μL进行菌落的PCR扩增，对菌落PCR扩增产物和鉴定有亮斑的菌液进行测序。选择测序结果与插入片段符合的菌落，其余菌液扩大培养。取30 μL 菌液加入50 mL 培养基中，培养12 h 后，使用Tiangen 无内毒素试剂盒（小提中量）提取质粒。

1.5 基因敲除细胞的制备

将HEK-293T细胞接种至6孔板中，生长至80%时，利用HEK-293T细胞包装慢病毒。转染前2 h，移除细胞培养基，更换为新鲜的完全培养基。离心管中加入100 μL 的OPTI-MEM，再按质量比3∶2∶4（质粒质量分别为0.67、0.44、0.89 μg）加入包装质粒psPAX2、病毒外壳质粒pMD2.G和核心质粒，混合均匀。采用6 孔板进行包装，DNA 总量为2 μg，每孔加入Neofect 2 μL，混匀静置25 min，将混合液加入HEK-293T细胞培养基中。转染6～12 h后，更换培养基，继续培养。分别在转染后24、48和72 h时收集上清。

在2 个6 孔板中分别接种PK15-CD163-Cas9 细胞和IPEC-J2-Cas9 细胞，生长到60%左右时，在培养基中加入100 μL 包装48 h 后收取的慢病毒液（48 h慢病毒液效果最好），轻摇混匀。6 h后，将培养基吸弃，换入新鲜培养基。从第2 天开始，将培养液换成含有潮霉素B（300 ng/mL）的培养基，共筛选7 d，即可得到3 个基因分别被敲除的细胞。用表2所示引物对gRNA靶向区域进行扩增，并对PCR产物进行测序，将靶向区域与原序列进行对比，即可得知敲除效果。若靶向区域出现碱基缺失，则基因敲除成功。

表2 用于扩增gRNA靶向敲除区域的引物序列Table 2 Primer sequences used to amplify gRNA knockout sites

1.6 病毒基因表达量的qPCR检测

将PRRSV（MOI=0.1）感染PK15-CD163-Cas9-NC（对照组，基因未敲除）和3 个基因分别敲除的3种细胞（试验组），在12、24 及48 h，分别收取对照组和试验组中的细胞，从细胞中提取RNA，反转录为cDNA，并进行相对定量PCR 分析（ATP6V0A1敲除组12、24 h实验重复5次，48 h实验重复7次；IL20RB敲除组12、24 h 实验重复5 次，48 h 实验重复7 次；STX10敲除组实验重复3 次），感染24、48 h 细胞内ORF7基因的表达量能有效反映PRRSV 感染水平。用PEDV（MOI=0.1）分别感染基因ATP6V0A1、IL20RB和STX10被敲除的3 种细胞（IPEC-J2-Cas9-ATP6V0A1、IPEC-J2-Cas9-IL20RB 和 IPEC-J2-Cas9-STX10）（试验组）和IPEC-J2-Cas9-NC 细胞（对照组）。因为笔者所在实验室前期研究表明感染24 h 能有效地反映PEDV 感染水平，而且在IPECJ2-Cas9-NC 细胞和IPEC-J2-Cas9 细胞中PEDV 感染效果类似，故本研究只比较分析感染后第24 小时的PEDV感染情况。

在感染后24 h，对照组细胞大量死亡，为了检测细胞内及培养液中所有病毒含量，收取细胞及其上清，根据PEDV 的N 蛋白基因设计引物，对PEDV 的N 蛋白基因表达量进行绝对定量PCR 检测。引物序列如表3所示，绝对定量的标准曲线如图1所示。

图1 PEDV绝对定量所用标准曲线Fig.1 Standard curve for absolute quantification of PEDV

1.7 t检验及方差分析

利用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，定量数据采用方差分析和参数检验、双尾未配对t检验进行评估。分别对试验组和对照组病毒感染后的病毒基因表达量进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 ATP6V0A1、IL20RB 和STX10 基因分别敲除及其对PRRSV感染的作用

对连接gRNA 的载体进行测序鉴定，结果如图2所示。

图2 靶向基因敲除的gRNA表达载体的测序鉴定Fig.2 Knocked-out gRNA expression vectors targeted genes’sequencing identification

从图2可以看出，在PLH-sgRNA1-hygb载体中，分别插入了ATP6V0A1、IL20RB和STX10基因敲除的gRNA 序列（表1），gRNA 与表达载体连接正确，表明靶向3 个基因分别被敲除的3 个gRNA 表达载体构建成功。

用潮霉素B（300 ng/mL）筛选10 d 后，得到gRNA 靶向目的基因敲除的存活细胞（图3B）。扩增靶向区域得到PCR 产物（图4），对PCR 产物进行测序。从图5中可以看出：与NCBI数据库中基因序列相比，目标序列附近出现基因编辑导致的杂峰现象，表明gRNA靶向区附近碱基被敲除，3个基因分别被敲除的3 种细胞（PK15-CD163-Cas9-IL20RB、PK15-CD163-Cas9-ATP6V0A1、PK15-CD163-Cas9-STX10）制备成功。

图3 用潮霉素B筛选ATP6V0A1基因被敲除的存活细胞Fig.3 Live cells knocked ATP6V0A1 gene selected of by hygromycin B

图4 靶向敲除区域的PCR产物电泳检测Fig.4 PCR products targeted in knocked-out region detected by electrophoresis

图5 基因敲除的PK-15细胞中ATP6V0A1、IL20RB和STX10基因测序鉴定Fig.5 Sequencing identification of ATP6V0A1，IL20RB and STX10 in gene-knocked-out PK-15 cells

用PRRSV（MOI=0.1）感染3个基因分别被敲除的PK15-CD163-Cas9-IL20RB、PK15-CD163-Cas9-ATP6V0A1、PK15-CD163-Cas9- STX10 细胞（试验组）和未敲除基因的细胞（对照组，PK15-CD163-Cas9-NC）。从荧光定量PCR 检测结果（图6）可知，与对照组相比，PRRSV 感染ATP6V0A1基因被敲除的试验组细胞PK15-CD163-Cas9-ATP6V0A1 后的第12 小时显著（P（12 h）=1.04×10-2）、第48小时极显著（P（48 h）= 4.49×10-3）降低ORF7表达量（因感染24 h 样本收集不成功，没有第24 小时的数据），说明ATP6V0A1敲除和功能缺失可显著抑制PRRSV 增殖。

图6 ATP6V0A1敲除后PRRSV基因ORF7的相对表达量Fig.6 The related expression of PRRSV gene ORF7 after ATP6V0A1 knocked-out

PCR 检测结果显示，PRRSV 感染试验组细胞（IL20RB基 因 被 敲 除 的 PK15-CD163-Cas9-IL20RB），感染后的第12、24 及48 小时的ORF7表达量显著低于对照组（图7），重复3 次感染试验均得到类似的结果（P（12 h）=2.03×10-4，P（24 h）=1.45×10-4，P（48 h）=7.84×10-7）。表明PK15 细胞IL20RB敲除（该基因功能缺失）能显著抑制PRRSV增殖。

图7 IL20RB敲除后PRRSV基因ORF7的相对表达量Fig.7 The related expression of PRRSV gene ORF7 after IL20RB knocked-out

用PRRSV 感染STX10基因被敲除的试验组细胞PK15-CD163-Cas9-STX10，感染后第24 及48 小时的ORF7表达量均显著低于对照组（PK15-CD163-Cas9-NC），其中24 h病毒ORF7表达量更低（图8），3次重复试验结果均相似（P（12 h）=4.94×10-1，P（24 h）=2.15×10-3，P（48 h）=1.16×10-3）。证实STX10敲除（该基因功能缺失）能显著抑制PRRSV增殖，其抑制作用在感染24 h较强。

图8 STX10敲除后PRRSV基因ORF7的相对表达量Fig.8 The related expression of PRRSV gene ORF7 after STX10 knocked-out

2.2 ATP6V0A1、IL20RB 和STX10 基因分别敲除及其对PEDV增殖的抑制作用

由于PEDV 不能感染猪PK-15 和PK15-CD163细胞，但可感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2），笔者所在实验室前期已制备了可用于基因敲除且可被PEDV 感染的IPEC-J2-Cas9 细胞，故本研究利用CRISPR/Cas9 技术在IPEC-J2-Cas9 细胞中分别敲除3 个基因，研究基因敲除对PEDV 增殖的作用。

在筛选第7 天时，对照组细胞死亡，试验组还有少量存活细胞，即为整合了gRNA 表达载体、gRNA靶向目的基因敲除的存活细胞，如图9所示。

图9 基因ATP6V0A1敲除的细胞（IPEC-J2-Cas9-ATP6V0A1，潮霉素B筛选第7天）Fig.9 The cells knocked gene ATP6V0A1（IPEC-J2-Cas9-ATP6V0A1，sellected using hygromycin B on 7 days）

提取存活细胞中基因组DNA，PCR 扩增gRNA靶向区域附近片段，得到如图10 所示的PCR 产物。扩增片段测序结果与该基因序列（NCBI 数据库）进行比对，如图11 所示，测序结果表明gRNA 靶向区域的碱基被编辑，3 个基因分别敲除的3 种细胞（IPEC-J2-Cas9-ATP6V0A1、IPEC-J2-Cas9-IL20RB 和IPEC-J2-Cas9-STX10，为混合细胞）制备成功。

图10 靶向敲除区域的PCR产物Fig.10 PCR products targeted in knocked region

图11 基因敲除IPEC-J2细胞中ATP6V0A1、IL20RB和STX10基因测序鉴定Fig.11 Sequencing identification of ATP6V0A1，IL20RB and STX10 gene in geneknockout IPEC-J2 cells

从图11 可以看出，与对照组相比，在24 h 的3个基因分别敲除的试验组细胞中，PEDV 的N 蛋白表达量显著降低。3 次重复试验均获得类似结果。

从图12可以看出，与对照组的PEDV RNA 拷贝数（均值：4.68×106）相比，试验组出现了不同程度的显著下降（ATP6V0A1组均值：6.35×104，IL20RB组均值：1.16×106，STX10 组均值：3.72×105）。表明ATP6V0A1被敲除对PEDV 增殖抑制效果最显著，IL20RB被敲除细胞和STX10被敲除对PEDV 增殖也具有显著抑制作用。

图12 荧光定量PCR检测PEDV拷贝数Fig.12 PEDV copy number detected by fluorescence quantitative PCR

3 讨 论

CRISPR/Cas9基因敲除技术可有效对gRNA 靶向的位点进行编辑敲除，本研究结果显示，用该技术分别敲除细胞中ATP6V0A1、IL20RB和STX10基因后对PRRSV、PEDV感染均有显著抑制作用。

IL20RB作为促炎性因子，主要参与炎症早期反应，IL20RB基因敲除后，细胞炎症和早期免疫反应可能会受影响，从而影响病毒增殖。IL-10、IL-20、IL-24 均可利用与IL20RB 形成的受体复合物传输信号，IL-10 影响机体的免疫抑制过程［13］。Zhang等［14-15］发现宿主细胞中Ⅰ型干扰素（IFNs）的产生会被PRRSV 抑制，影响下游IFN 刺激基因（ISG）触发的抗病毒免疫反应，从而使PRRSV 进行免疫逃避。敲除IL20RB基因可能导致IL-10 等细胞因子的信号传输受阻，从而导致病毒无法抑制IFN表达，降低了病毒对免疫机制的调控和逃避能力，使得病毒被宿主免疫和清除，从而抑制病毒增殖。

敲除ATP6V0A1影响了胞内运输和酸碱平衡等过程，从而降低了病毒感染增殖速度。PEDV借助低pH 值进入细胞，敲除ATP6V0A1可能导致细胞无法形成低pH 值环境，PEDV 进入细胞过程受阻。现有研究表明，PEDV通过网格蛋白和微囊蛋白介导的内吞途径进入细胞，也可以通过脂筏介导的内吞作用进入细胞；内化的PEDV 病毒颗粒通过早期内体-晚期内体-溶酶体途径到达溶酶体［16］。在PRRSV感染细胞的早期阶段，PRRSV 颗粒先后被转运到内体和溶酶体中［17］，敲除ATP6V0A1导致胞内运输过程受阻，可能影响了内体的酸化与成熟，延长了内体到溶酶体的时间，使得病毒在细胞内的复制周期延长。

Lucas 等［18］发现沙眼衣原体会利用STX10拦截宿主的囊泡转运系统以获取营养物质，而在细胞代谢所需的戊糖磷酸途径被抑制时，猪圆环病毒滴度会明显下降［19］，因此病毒可能利用STX10来控制囊泡转运途径为自己的代谢提供物质，当STX10基因敲除后，病毒代谢所需的物质无法正常运输，导致病毒增殖受阻；STX 家族参与组成的SNARE 复合体能够控制膜融合，调节狂犬病毒在神经细胞中释放，使病毒子代滴度下降。STX10参与突触小泡形成，也与自噬及病毒释放过程有关［20］，病毒利用自噬途径，如PRRSV 感染会引起细胞线粒体自噬，干扰动态相关蛋白（dynamic related protein，Drp1）。PRRSV 感染细胞后的12 h 内即会诱导自噬体的形成，从而抑制PRRSV 感染导致的细胞凋亡，延长细胞存活时间，便于病毒增殖［21］，PEDV 感染vero 细胞时诱导完全自噬进程，从而促进PEDV 复制［22］。而STX10参与内体与高尔基体的互作过程，从而影响自噬过程。当敲除自噬相关的STX10基因后，病毒利用自噬抑制细胞凋亡的途径可能受阻，病毒复制微环境受损，胞内增殖的时间减少，复制量下降。

PRRSV 感染敲除STX10基因的细胞后，12 h 内病毒增殖未受影响，而24、48 h 内病毒增殖量显著降低，表明STX10主要影响PRRSV 增殖的时间点在感染后12～24 h，而病毒前期复制未受影响，可能是病毒的释放、组装过程受到了影响。有研究［20］报道过表达STX4能够促进丙肝病毒的释放，STX家族参与组成的SNARE 复合体也会影响狂犬病毒的释放，对初代病毒的感染无影响，子代病毒的滴度下降，此次试验也出现了类似现象，表明PRRSV 的释放过程可能也需要SNARE 复合体的参与，敲除STX10使SNARE 复合体组装过程受影响，病毒难以释放导致复制量下降。PEDV是否也在病毒释放过程受影响，还需要进一步对3 种基因敲除细胞在PEDV 感染后不同时间点进行检测。

综上所述，本研究制备了ATP6V0A1、IL20RB和STX10基因分别被敲除的3 种猪PK15-CD163 细胞以及3 种猪IPEC-J2 细胞，并证实了分别敲除3 个基因可显著抑制PRRSV和PEDV增殖。