β-胡萝卜素对母兔生长性能、抗氧化能力、生殖激素指标及卵泡发育的影响

2022-03-30魏宇超刘福鑫陈宝江王志刚

动物营养学报 2022年3期

孙磊魏宇超刘福鑫陈宝江, 王志刚

(1.河北农业大学动物科技学院，保定071000；2.河北省牛羊胚胎技术创新中心，保定071000)

β-胡萝卜素(β-carotene)是类胡萝卜素的一种，主要分布于植物和细菌体内的光合作用器官中，动物体内不能合成，是维生素A的前体物质，具有与维生素A相似的生理功能，能够预防维生素A缺乏所导致的疾病。动物体内β-胡萝卜素可以保护子宫、卵巢及活性生殖细胞免受氧化反应的破坏，增强动物的繁殖能力，提高生长性能。β-胡萝卜素还是黄体细胞微粒体膜的组成成分，可刺激黄体细胞合成孕酮(PROG)而维持妊娠，提高子宫、卵巢生殖细胞活性，减少胚胎死亡和早期流产[1]。葛金山等[2]在母猪基础饲粮中添加100 mg/kg β-胡萝卜素，发现母猪的窝产活仔数和出生窝重均显著提高。冯俊等[3]在妊娠后期母猪饲粮中添加160 mg/kg微囊化β-胡萝卜素，发现仔猪初生重和初生窝重均显著提高，但对产活仔数无显著影响。李梓妍等[4]研究发现，奶牛产后饲粮中添加β-胡萝卜素能缩短产后首次发情时间，减少配种次数，提高受胎率，降低生殖疾病的发生。Brief等[5]给配种后期母猪注射12 300 IU维生素A和32.6 mg β-胡萝卜素，结果发现母猪血清中维生素A、β-胡萝卜素含量显著提高，早期胚胎死亡率显著降低，窝产活仔数、初生窝重、断奶活仔数和断奶窝重均显著提高。梁宁[6]研究发现，饲粮中添加复方β-胡萝卜素能够显著提高母猪繁殖性能，并且在每个繁殖阶段起到了不同的作用。

目前关于饲粮中添加β-胡萝卜素的研究主要集中于猪和反刍动物，家兔是一种繁殖力更强的小型草食动物，对与繁殖相关营养素需要更多，但有关家兔饲粮中添加β-胡萝卜素的报道极少。因此，本试验旨在研究饲粮中添加不同水平β-胡萝卜素对母兔生长性能、抗氧化能力、生殖激素指标及卵泡发育的影响，为β-胡萝卜素在家兔生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

动物试验于2020年12月至2021年3月于河北省保定市唐县北罗镇华益兔业养殖基地进行。选取55～60日龄、体重[(1.679±0.114) kg]相近、健康状态良好的伊拉父母代母兔160只，随机分为4组，每组20个重复，每个重复2只。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中分别添加15、30、45 mg/kg β-胡萝卜素。预试期7 d，正试期84 d。整个试验期母兔自由采食和饮水。

1.2 基础饲粮

基础饲粮以玉米、小麦麸、豆粕为主要原料，参照谷子林等[7]推荐的兔营养需要配制，制成直径×长度为4 mm×10 mm的颗粒料。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.3 样品采集

分别于试验第70和84天，每组随机选取6只母兔进行血液采集，并分离血清样品，-20 ℃保存，用于测定血清抗氧化和激素指标。试验第84天，每组随机选取6只母兔进行屠宰，取右侧卵巢样品于5 mL冻存管中，-80 ℃保存，用于测定卵巢抗氧化和激素指标。另取左侧卵巢样品，经生理盐水冲洗干净后，放入10%多聚甲醛溶液中，用于测量卵巢组织形态。

1.4 检测指标及检测方法

1.4.1 生长性能

试验期开始和结束时，以重复为单位称量各组母兔的体重，获得初始体重和终末体重，计算总增重以及平均日增重(ADG)；试验期间记录各组母兔每天采食量，计算平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。计算公式如下：

总增重=终末体重-初始体重；
ADG=(终末体重-初始体重)/试验天数；
ADFI=(投料量-余料量)/(试验动物数×
试验天数)；
F/G=总采食量/总增重。

1.4.2 抗氧化指标

测定血清以及组织匀浆后的卵巢样品中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)。利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法进行检测，ELISA试剂盒购于南京建成生物工程研究所，参照内置说明书进行检测。

1.4.3 激素指标

测定血清以及组织匀浆后的卵巢样品中促黄体素(LH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、PROG含量。利用ELISA法进行检测，ELISA试剂盒购于南京建成生物工程研究所，参照内置说明书进行检测。

1.4.4 卵巢组织形态

固定组织经脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片后采用匈牙利3DHISTECH公司生产的Pannoramic 250数字切片扫描仪对切片进行图像采集，采用麦克奥迪实业集团有限公司生产的Panthera数码三目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于40倍下观察全部组织，观察大体病变，采集40倍和200倍图片，并计算初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡和黄体比例。

1.5 数据统计分析

试验数据利用Excel 2010进行整理和初步计算，再利用SPSS 25.0一般线性模型(GLM)进行多因素方差分析。单个因素间的比较则利用SPSS 25.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法进行多重比较。统计模型中包括添加水平、时间和添加水平×时间。数据以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 β-胡萝卜素对母兔生长性能的影响

由表2可知，饲粮中添加不同水平β-胡萝卜素对母兔的终末体重、总增重、ADG、ADFI以及F/G均无显著影响(P>0.05)。

表2 β-胡萝卜素对母兔生长性能的影响

2.2 β-萝卜素对母兔抗氧化功能的影响

2.2.1 β-萝卜素对母兔血清抗氧化指标的影响

由表3可知，饲粮中添加不同水平β-胡萝卜素对血清中SOD活性有显著影响(P<0.05)，对血清中GSH-Px活性、MDA含量和T-AOC没有显著影响(P>0.05)。与对照组相比，饲粮中添加45 mg/kg β-胡萝卜素显著降低了血清中SOD活性(P<0.05)。时间对母兔血清中SOD、GSH-Px活性和T-AOC有显著影响(P<0.05)，对血清中MDA含量没有显著影响(P>0.05)。随着时间的增加，母兔血清中SOD、GSH-Px活性和T-AOC显著升高(P<0.05)。添加水平和时间的互作效应对母兔血清中SOD活性有显著影响(P<0.05)，对血清中GSH-Px活性、MDA含量和T-AOC没有显著影响(P>0.05)。

表3 β-胡萝卜素对母兔血清抗氧化指标的影响

2.2.2 β-胡萝卜素对母兔卵巢抗氧化指标的影响

由表4可知，饲粮中添加不同水平β-胡萝卜素对卵巢中SOD、GSH-Px活性和MDA含量以及T-AOC均无显著影响(P>0.05)。

表4 β-胡萝卜素对母兔卵巢抗氧化指标的影响

2.3 β-胡萝卜素对母兔生殖激素指标的影响

2.3.1 β-胡萝卜素对母兔血清生殖激素指标的影响

由表5可知，第70天时，饲粮中添加不同水平β-胡萝卜素对血清中LH和E2含量均无显著影响(P>0.05)；与对照组相比，饲粮中添加30 mg/kg β-胡萝卜素显著降低了血清中FSH和PROG含量(P<0.05)。第84天时，饲粮中添加不同水平β-胡萝卜素对血清中LH、FSH、E2和PROG含量均无显著影响(P>0.05)。

表5 β-胡萝卜素对母兔血清生殖激素指标的影响

2.3.2 β-胡萝卜素对母兔卵巢生殖激素指标的影响

由表6可知，饲粮中添加不同水平β-胡萝卜素对卵巢中LH和FSH含量均无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，饲粮中添加30 mg/kg β-胡萝卜素显著提高了卵巢中E2含量(P<0.05)；45 mg/kg β-胡萝卜素组卵巢中E2含量显著低于15和30 mg/kg β-胡萝卜素组(P<0.05)。与对照组相比，饲粮中添加15 mg/kg β-胡萝卜素显著降低了卵巢中PROG含量(P<0.05)；15 mg/kg β-胡萝卜素组卵巢中PROG含量显著低于30 mg/kg β-胡萝卜素组(P<0.05)。

2.4 β-胡萝卜素对母兔卵泡发育的影响

由图1可知，与对照组相比，饲粮中添加β-胡萝卜素提高了母兔初级卵泡比例，其中45 mg/kg β-胡萝卜素组达到显著水平(P<0.05)；饲粮中添加β-胡萝卜素降低了闭锁卵泡比例(P>0.05)，提高了成熟卵泡和黄体比例(P>0.05)。

数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 讨论

3.1 β-胡萝卜素对母兔生长性能的影响

β-胡萝卜素是由植物自身合成的维生素A的前体物质，具有特定生物活性功能。贾福昌等[8]研究表明，在维生素A水平相同的情况下，饲粮中额外添加40 mg/kg β-胡萝卜组可以提高6周龄新西兰兔增长速度，降低F/G。马诚等[9]研究发现，给7周龄Wistar大鼠添加10 mg/(kg·d) β-胡萝卜素，对其体重和生长发育无显著影响。褚千然等[10]研究发现，在蛋雏鸡饲粮中添加β-胡萝卜素对21日龄体重及胫骨长度无显著影响。本试验中，饲粮中添加不同水平β-胡萝卜素对母兔生长性能没有显著影响，其原因可能是本试验所添加的β-胡萝卜素主要发挥了维生素A前体作用，但具体机理有待研究。

3.2 β-萝卜素对母兔抗氧化能力的影响

机体内抗氧化酶是抗氧化系统的重要组成部分，主要包括SOD、GSH-Px和过氧化氢酶(CAT)等，可以抑制体内自由基的生成并且清除体内多余的自由基。β-胡萝卜素具是一种良好的抗氧化剂，能够减少细胞内脂质氧化物的产生，缓解氧化应激带来的病症[11]。β-胡萝卜素分子结构含有多个共轭双键，能够捕捉、淬灭自由基和单线态氧，减少自由基对细胞膜和细胞遗传物质的损伤[12-13]。本试验结果发现，饲粮中添加15 mg/kg β-胡萝卜素可以提高母兔血清中SOD活性，与任延利等[14]、张相伦等[15]、马诚等[9]研究结果一致。这是由于β-胡萝卜素是一类非酶抗氧化物质，可以上调核因子E2相关因子2(Nrf2)mRNA相对表达量，激活Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)-Nrf2-抗氧化反应元件(ARE)通路，进而增加抗氧化酶基因的表达量，推动抗氧化酶发挥作用[16-18]。另外，本研究发现添加低剂量β-胡萝卜素有提高母兔血清和卵巢组织中SOD活性的趋势，说明β-胡萝卜素可以提高卵巢组织的抗氧化能力，保护卵泡细胞完整性，进而加快卵泡发育以及生殖激素分泌。

有研究表明，机体抗氧化能力与β-胡萝卜素添加水平呈非线性相关，β-胡萝卜素添加水平并非越高越好，过量的添加β-胡萝卜素同样会造成机体抗氧化功能的降低甚至丧失[19]。Khopde等[20]研究发现，高添加水平的β-胡萝卜素未表现抗氧化作用。梁惠等[21]研究表明，补充15.0 mg/(kg·d)β-胡萝卜素对成年Wistar大鼠DNA损伤无明显防护作用，而补充4.28 mg/(kg·d)β-胡萝卜素则可发挥较好的抗氧化和降低烷化损伤效果。这说明高水平β-胡萝卜素对机体抗氧化产生了负面影响。本试验结果也证实，饲粮中添加45 mg/kg β-胡萝卜素会导致母兔血清中SOD活性显著降低。同时，45 mg/kg β-胡萝卜素组卵巢组织中SOD活性和T-AOC低于30 mg/kg β-胡萝卜素组。这说明母兔饲粮中过量添加β-胡萝卜素可能导致机体抗氧化能力下降，其机理有待进一步研究。

3.3 β-萝卜素对母兔繁殖激素指标的影响

动物的生殖活动受生殖激素的调控，一般认为，血清LH、FSH、E2以及PROG含量可以反映体内生殖激素情况，进而反映动物繁殖能力的高低。FSH与LH共同作用促进卵泡生长，分泌E2并排卵。E2能抑制FSH的合成和释放，与少量PROG协同促进LH的释放，维持黄体功能。PROG与E2共同作用，抑制FSH和LH的分泌，促使母畜发情[22]。β-胡萝卜素是黄体的固有成分，可以进入卵泡，调节激素分泌[23]。有研究发现，β-胡萝卜素通过提高吻素1(Kiss1)/G蛋白偶联受体54(GPR54)激活细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号途径，提高垂体中LH-β表达，促进LH分泌[24]。如Schweigert等[25]研究发现，在青年母猪饲粮中添加β-胡萝卜素(100 mg/kg)+维生素A(4 000 IU/kg)，直接影响了母猪卵巢类固醇激素的分泌，也可刺激黄体细胞分泌PROG；刘锐钢等[26]在妊娠后期母猪饲粮中添加160 mg/kg微囊化β-胡萝卜素，发现母猪妊娠第110天血清中E2和PROG含量显著提高；李梓妍[27]研究发现，在产后荷斯坦奶牛饲粮中添加β-胡萝卜素有升高血清中PROG含量的趋势。本试验结果发现，饲粮中添加30 mg/kg β-胡萝卜素可以显著提高母兔卵巢组织中E2含量，说明此剂量的β-胡萝卜素可能在母兔卵巢中发挥了积极作用。这可能与β-胡萝卜素作为黄体细胞的组成成分，可以促进雌性动物黄体分泌雌激素，进而促进PROG分泌有关。有研究发现，缺乏β-胡萝卜素而导致的黄体细胞PROG分泌减少的现象能通过补充β-胡萝卜素而得到改善[28-30]。另外，β-胡萝卜素的抗氧化特性能使卵泡细胞与子宫内膜细胞免受自由基的损害，从而促进生殖激素的分泌。与上述结果不同的是，本试验结果显示，与对照组相比，饲粮中添加30 mg/kg β-胡萝卜素显著降低了70 d血清中FSH和PROG含量，可能是由于血清中LH含量升高，影响了FSH的分泌，导致血清FSH含量降低[22]。值得注意的是，45 mg/kg β-胡萝卜素组母兔卵巢中FSH、E2以及PROG含量均低于30 mg/kg β-胡萝卜素组，可能是由于β-胡萝卜素添加水平过高导致的副作用，这与本试验抗氧化指标结果一致。但关于家兔饲粮中β-胡萝卜素的最高添加水平还没有相关报道，有待于进一步研究。

3.4 β-胡萝卜素对母兔卵泡发育的影响

在卵泡发育过程中，垂体分泌的促性腺激素(FSH和LH)起着重要作用，它可以促进卵母细胞的生长、卵泡细胞的增殖以及诱导卵泡排卵、黄体生成。原始卵泡发育成初级卵泡与促性腺激素关系不大，是一种局部作用。卵泡生长到4层颗粒细胞之后，一般才开始依靠生殖激素作用，生殖激素与卵巢颗粒细胞上的受体结合后启动发情，加快卵泡发育，提高卵泡质量[31-32]。β-胡萝卜素良好的抗氧化能力保护了卵巢细胞的完整性，促进卵泡发育。β-胡萝卜素还可以进入卵泡，调节激素分泌，进而加快卵泡发育。Meza-Herrera等[33]研究发现，在山羊饲粮中添加β-胡萝卜素可以促进卵泡发育。杨旭[34]研究发现，饲粮中添加β-胡萝卜素能够提高奶牛发情表现，促进卵泡发育及成熟，提高受胎率，减少受配次数。李超[35]研究发现，饲粮中添加β-胡萝卜素可促进产后奶牛子宫恢复和卵泡发育。本试验结果发现，饲粮中添加β-胡萝卜素对母兔初级卵泡发育有促进作用，同时有降低母兔闭锁卵泡比例的趋势，与上述结果大体一致。这说明饲粮中添加β-胡萝卜素可以通过其良好的抗氧化能力，保护卵巢免受自由基损害，促进初级卵泡发育；β-胡萝卜素在卵泡内调节机体FSH和LH分泌，减少了卵泡闭锁比例，从而对卵泡发育起到正向作用。