有柄石韦药膏制备及对大鼠伤口愈合作用的研究

陈 凯， 严 馨， 李天依， 冯佰欢， 张安东， 李 姝， 王元宵， 黄 敏， 曹 玫

(1. 电子科技大学附属医院·四川省人民医院， 成都 610072； 2. 四川大学生命科学学院 资源微生物学与生物技术重点实验室， 成都 610064； 3.四川省原子能研究院 辐照保藏四川省重点实验室， 成都 610101)

《神农本草经》中记载，有柄石韦(Pyrrosiapetiolosa,P.petiolosa)属于水龙骨科石韦属植物，具有清肺泄热、利尿通淋、清热止血的功效.其可作为金疮药用于伤口止血、预防伤口感染、加快伤口恢复，效果良好[1].金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是导致伤口感染的最主要致病菌之一，利用抗生素治疗微生物感染是临床上常用的手段，但随着抗生素的使用，病原微生物抗生素耐药现象也变得日趋严重.本课题组前期研究工作发现P.petiolosa内生真菌、内生细菌发酵物中具有丰富的抑菌活性物质[2, 3]；此外，P.petiolosa提取物中含有圣草酚、山奈酚等抑菌物质，体外对S.aureus等原核微生物、犬小孢子菌(Microsporumcanis)等真菌有显著抑制作用，且P.petiolosa提取物及有效成分山奈酚等物质可以显著降低S.aureus毒力因子hla、sea的表达水平[4, 5].对于外伤伤口治疗，除传统的抗生素外，临床上也使用一些抗感染或促进伤口愈合的中药膏剂[6].具有清热解毒、活血化瘀、煨脓长肉及祛腐生肌功效的中药可以涂于难以愈合的伤口表面，通过调节各种细胞生长，改善局部微环境，控制局部感染，从而起到促进伤口愈合的作用[7, 8].本研究将首次利用有柄石韦试制药膏，在动物水平研究其抗菌和促伤口愈合的作用，为川西北羌族药用植物有柄石韦的开发提供指导意义，为中国传统药用植物的研究作出了一定的贡献.

2 材料与方法

2.1 实验材料

有柄石韦：P.petiolosa采自四川省阿坝藏族羌族自治州汶川县绵虒镇，取植物叶片阴干后保存备用.

菌种：S.aureus由四川省资源微生物学与生物技术重点实验室保存.

SD大鼠： SD大鼠为无特定病原体(SPF)级合格动物，60日龄左右，由成都达硕实验动物提供，生产许可证号为SCXK(川)2018-030.

主要试剂：乙酸乙酯、无水乙醇、京万红软膏等购于金蜀都化验设备有限公司和成都科龙化工集团，冰片、薄荷、三七等购于成都市武侯区思义诊所，FGF-2、TNF-α和IL-6检测用ELISA试剂盒购于北京方程生物科技有限公司.

主要仪器：艾科浦超纯水系统AFZ-1002-U(艾科浦公司)、分析天平SL502N(上海民桥精密仪器科技有限公司)、旋转蒸发仪BD1110(上海康仪仪器有限公司)、高速粉碎机WK-1000A(重庆瑞仟顺制药设备有限公司)、病理组织包埋冷冻机BMJ-A型(江苏省常州市中威电子仪器有限公司)、病理组织切片RM2125(中国上海Leica)、电脑自动组织脱水机TSJ-SD(江苏省常州市中威电子仪器有限公司)等.

2.2 方 法

2.2.1 石韦药膏制备 药膏配方：鲜石韦50 g、干石韦10 g、冰片5 g、薄荷5 g、三七20 g、黄芪10 g、蜂蜡2 g、芝麻油25 mL.将鲜石韦粉碎后与乙酸乙酯按1∶20的比例混合后常温浸泡10 d，40 ℃旋转蒸发得到鲜石韦酯提物药膏1.将干石韦10 g、黄芪10 g、三七20 g、冰片5 g、薄荷5 g分别粉碎后，过80目筛，先与95%乙醇按1∶10的比例混匀40 ℃浸泡过夜，过滤后将滤液于80 ℃旋转蒸发得药膏2.将上述过滤后的药材再与水按1∶10的比例混合后文火熬制1 h，过滤掉滤渣后继续文火熬制并加入2 g蜂蜡，熬成30 mL膏状物冷却后备用，此为药膏3.将药膏1、药膏2与芝麻油融合后再与药膏3搅拌均匀，试制得到实验用石韦药膏.

2.2.2 SD大鼠创伤建模 选取体重约200 g的SD大鼠在SPF 级动物房日常饲养，观察1 w、无死亡和精神异常后进行相关试验.按照7 mL/100 g的标准将5%水合氯醛腹腔注射供试大鼠，将大鼠的背部毛发逆向剪去，然后用皮肤活检器和剪刀在大鼠的两侧分别制造一个直径为 9±1 mm的圆形全层切除伤口[9].将创口表面的分泌物和坏死组织用沾生理盐水的湿润纱布轻轻拭去，然后用5%苦味酸乙醇溶液标记毛发以区分不同个体.

2.2.3 SD大鼠分组与药膏处理 将创伤建模大鼠分为两组：单纯创伤组、S.aureus感染组.单纯创伤组再细分成3小组，分别为自然暴露组、石韦药膏处理组和京万红软膏处理组，每组12只.S.aureus感染组经过前期创伤建模，用生理盐水清洗后，在每个伤口上接种20 μL 1×108CFU/mLS.aureus菌悬液，感染1 d后进行后续试验；S.aureus感染组细分成3小组，S.aureus感染/自然暴露组、S.aureus感染/石韦药膏处理组和S.aureus感染/京万红软膏处理组，每组12只.

自然暴露组不涂抹任何药物，作为阴性对照；石韦药膏处理组每个创面涂抹100 μL石韦药膏，早晚各1次；京万红软膏处理组，每个创面涂抹上100 μL京万红软膏，早晚各1次，该组为阳性对照.给药后喂食，连续给药3 w.

2.2.4 体重与进食情况测量 实验期间，每天每组早上八点给饲料250 g、测定前一天饲料消耗量(进食量)和各组大鼠的体重，并做好详细记录.

2.2.5 创面愈合情况测量 分别在给药后第3 d、7 d、14 d、21 d以直尺作为对照标准，对伤口处进行拍照保存，通过Image软件计算伤口面积并记录.

2.2.6 创伤组织病理学检测 每组实验组共计12只大鼠，分别在给药后第3 d、7 d、14 d、21 d随机抽取3只大鼠采用腹腔麻醉的方法麻醉大鼠并进行创伤组织取样，剪取麻醉大鼠的创面皮肤组织(2 cm×2 cm).用生理盐水清洗取下的创伤组织的血液，一部分创面用4%多聚甲醛固定24 h，经过组织洗涤、脱水、透明，将创面组织放入65 ℃融化的石蜡中浸蜡3次，每次1 h，切成4 μm切片，组织切片烘烤后进行染色，再经过烘干、封片，进行显微镜观察与拍照.

2.2.7 血样采集与炎性因子表达水平测定 每组实验组共计12只大鼠，分别在给药后第3 d、7 d、14 d、21 d随机抽取3只大鼠采用腹腔麻醉的方法在麻醉状态下背动脉全血采集3 mL至抗凝管内轻微摇晃.将收集的血样放于室温静置4 h后3000 r/min离心10 min，小心吸取上清液，得到血清样品，存放于-80 ℃备用.根据ELISA试剂盒说明书分别对各个时间段各个实验处理的血清样本进行FGF-2、TNF-α和IL-6炎性因子表达水平的测定并记录数据.

2.2.8 统计分析 通过GraphPad Prism7软件对体重、进食量、创面愈合率、相关炎性因子ELISA数据进行T检验，根据组间差异性作图.

3 结 果

3.1 SD大鼠体重与进食量变化情况

给药后每天早晨八点进行体重和进食量统计，根据21 d各组大鼠的体重和进食量数据分析，单纯创伤组和S.aureus感染组之间以及各不同给药处理方式小组之间大鼠体重无显著性差异，进食量无显著性差异，实验组大鼠与对照组大鼠生长状态良好，未受手术创伤和给药处理的影响.这表明石韦药膏和阳性对照京万红药膏处理均不会影响大鼠的正常进食和生长(如图1和图2).

图1 大鼠体重变化Fig.1 Changes of body weight in rats

图2 大鼠进食量变化Fig.2 Changes of food intake in rats

在给药后测量大鼠的伤口愈合面积，据图3a显示，在正常创伤组中，治疗3 d后石韦药膏组伤口愈合率为65%，显著高于自然恢复组和京万红组；治疗7 d后石韦药膏组与京万红组相比伤口愈合率无显著性差异，但均高于自然恢复组；治疗14 d后，大鼠伤口愈合率达到98%以上，伤口基本恢复，且石韦药膏组的伤口愈合率显著高于京万红组和自然恢复组；此外，在S.aureus感染组中也观察到了类似的结果(如图3b).由此推测P.petiolosa药膏可促进正常创伤及创伤兼S.aureus感染后的伤口愈合.

图3 伤口愈合率分析(a) 单纯创伤组； (b) S.aureus感染组Fig.3 Statistical analysis of wound-healing rates(a) normal trauma group; (b) S.aureus infection group

3.3 创伤组织病理学分析

3.3.1 正常创伤组病理分析 如图4所示，治疗3 d后，正常创伤自然恢复组、石韦药膏组和京万红组创面部位皮肤表皮和真皮层结构均已缺失，自然恢复组皮下组织缺失，但石韦药膏组和京万红组均可见皮下组织.各实验组创面由新生肉芽组织填充，肉芽组织内可见较多以中性粒细胞为主的炎细胞浸润，肉芽组织上覆盖坏死层，石韦药膏治疗组炎性细胞浸润较其余两组较轻.

治疗7 d后，各实验组坏死层厚度明显变薄，修复部位炎症进一步减轻，修复面肉芽组织下有纤维细胞形成，创面边缘可见部分上皮生成；治疗14 d实验各组大鼠皮肤创面均已变平并被新生表皮组织全部覆盖，修复面真皮层全部被纤维组织替代，纤维组织排列整齐紧密，纤维层内并可见少量毛囊，但未见皮脂腺，修复面内已未见坏死灶，仅可见少量炎性细胞浸润.

图4 正常创伤组不同处理不同时间伤口愈合情况Fig.4 Wound healing in normal trauma group at different treatment times

3.3.2S.aureus感染组病理分析 如图5所示，治疗3 d后，S.aureus感染组可见较多以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，与正常创伤组相比中性粒细胞数量增加，坏死层厚度增加，自然恢复组和京万红治疗组部分创面中央部位还未得到肉芽组织填充，石韦药膏治疗组未见明显不同的组织形态结构.

治疗7 d后，各实验组新生肉芽组织填充，肉芽组织上覆盖坏死层，且坏死层厚度明显变薄，自然恢复组可见炎症减轻程度小于石韦药膏组和京万红组.治疗14 d后，创面被新生表皮组织覆盖，修复面真皮层全部被纤维组织替代，但自然恢复组表皮组织与真皮层界定不明，表皮组织与纤维组织交错排列，不平整，愈合状况较差；石韦药膏组和京万红组创面已变平，纤维组织排列整齐紧密，界限分明，修复面内已未见坏死灶，部分组血管别再生，仅可见少量炎细胞浸润，恢复情况逐渐好转.

图5 S.aureus感染组不同处理不同时间伤口愈合情况Fig.5 Wound healing in S.aureus infection group at different treatment times

3.4 血清炎性因子表达水平分析

3.4.1 TNF-α表达差异性分析 TNF-α常被用作反应伤口局部炎症状态的指标之一.如图6a所示，在正常创伤组中，所有致创大鼠的TNF-α均显著高于空白未处理组，表明在伤口致创过程中出现了炎性反应；其中，石韦药膏组治疗3 d、7 d，其TNF-α的含量相较自然恢复组和京万红治疗组更低；在S.aureus感染组中，石韦药膏组治疗3 d，其TNF-α的含量明显低于自然恢复组和京万红治疗组，表明石韦药膏治疗组在致创前期可明显降低炎性反应(图6b).

图6 TNF-α表达分析 (a) 单纯创伤组； (b) S.aureus感染组Fig.6 TNF-α expression in different groups(a) normal trauma group；(b) S.aureus infection group

3.4.2 IL-6表达差异性分析 IL-6被认为是伤口炎性反应有价值的标志物，根据图7显示：在正常创伤组中，石韦药膏组分别治疗3 d、7 d、14 d，其IL-6的含量明显低于自然恢复组和京万红治疗组；治疗21 d后，各治疗组IL-6的含量与空白未处理组相比均无显著性差异(图7a).在S.aureus感染组中，S.aureus感染导致伤口炎症加剧，自然恢复组IL-6在3 d时明显升高，是空白未处理组的1.13倍且明显高于各治疗组，石韦药膏和京万红治疗组在前期很好的抑制了S.aureus对伤口的感染，IL-6增长趋势缓慢，愈合7 d后逐渐降低且石韦药膏组IL-6的含量低于京万红治疗组(图7b)，由此推测P.petiolosa药膏对S.aureus所致的伤口感染和创伤愈合的治疗效果优于阳性对照京万红治疗组.

图7 IL-6表达分析(a) 单纯创伤组； (b) S.aureus感染组Fig.7 IL-6 expression in different groups(a) normal trauma group；(b) S.aureus infection group

3.4.3 FGF-2表达差异性分析 如图8显示：在正常创伤组中，各处理组FGF-2的含量均高于空白未处理组；其中，石韦药膏治疗组在整个愈合中，FGF-2的含量在前期逐渐上升，7 d后逐渐减低，符合伤口愈合规律，且FGF-2的含量在愈合过程中的大部分时间内均高于自然恢复组和京万红治疗组(图8a)，在S.aureus感染组(图8b)中也观察到了类似的结果.FGF-2是由成纤维细胞、巨噬细胞，特别是内皮细胞在组织损伤时分泌的，对促进新生血管的形成具有重要作用.在FGF家族中，FGF-2、FGF-7和FGF-10已被证明在皮肤伤口愈合中有着不可或缺的作用[10].有研究表明，缺乏FGF-2的小鼠皮肤全层切除伤口的愈合会延迟.进一步说明了P.petiolosa药膏在抗感染、促进伤口愈合过程中具有一定的治疗效果.

图8 FGF-2表达分析(a) 单纯创伤组； (b) S.aureus感染组Fig.8 FGF2 expression in different groups(a) normal trauma group；(b) S.aureus infection group

4 讨 论

通过之前的实验发现，P.petiolosa乙酸乙酯提取物(PPEAE)和水提取物(PPAE)中含有大量抑菌物质，PPAE具有良好的促进伤口愈合的作用[11].另外中药三七可以消炎镇痛及止血[12]；黄芪具有抗菌抗病毒活性，对伤口感染及伤口愈合有一定效果[7]；薄荷也具有抗炎抑菌等作用[13].因此，本研究在对P.petiolosa提取液进行优化后，将鲜P.petiolosa和干P.petiolosa混用，再结合中药学理论知识，与三七、黄芪、薄荷等中药搭配制成药膏用于治疗外伤感染、促进伤口结痂愈合.

本研究通过建立大鼠感染模型，测定P.petiolosa药膏对创面愈合率、瘢痕面积、致创期间血清中炎性因子的表达等判断药膏在伤口愈合和抗感染过程中的作用.根据数据显示，以P.petiolosa为主体的药膏可缩短伤口愈合时间、提高伤口愈合率，且药膏组治疗后的瘢痕面积显著小于自然恢复组和阳性对照京万红治疗组.同时在被S.aureus感染的伤口治疗过程中，通过HE病理切片结果及血清中TNF-α、IL-6、FGF-2等细胞因子变化情况显示，P.petiolosa药膏可拮抗S.aureus感染并促进伤口愈合，降低中性粒细胞等炎性细胞浸润，促进肉芽组织生长、纤维细胞形成、表皮组织生长、真皮层形成和毛囊再生，恢复皮肤弹性.以上结果说明这款自主研发的以P.petiolosa为主要原料的中药药膏具有很好的拮抗S.aureus、促进伤口愈合的效果；且本药膏杀菌效果好、副作用小、易被皮肤吸收、创面愈合后疤痕面积小，有效解决了现有的药膏存在的杀菌能力弱，创口愈合率低和祛疤效果差的问题.