基于细胞凋亡芯片的白花败酱草乙酸乙酯部位抗结肠癌的物质基础研究

丁昕瑶，王帅，李天娇，赵琳，包永睿，孟宪生（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600）

白花败酱，来源于败酱科败酱属，其名首载于春秋时期的《范子计然》。白花败酱草味辛、苦，性微寒，具有清热解毒、活血化瘀之功，可用于治疗肠痈、燥热便秘、产后瘀血等症。临床上常用于溃疡性结肠炎、慢性胃炎、肿瘤等疾病。根据文献调研及前期体外药效学实验研究发现，白花败酱草乙酸乙酯部位对结肠癌具有较好的抑制作用，但其化学成分与药效间关系并未得到合理解释。

微流控芯片是由微米级尺寸的微通道组成的芯片。它将传统化学生物实验室的各种功能集成到一起，与常规96 孔板相比，微流控芯片细胞培养法能更好地模拟细胞在人体内的生存环境。微流控芯片技术用于体外药效评价具有高灵敏度、快速简便、消耗低等优势。本实验将微流控芯片技术与荧光技术相结合，通过灰色关联度及偏最小二乘回归分析法分析白花败酱草谱效关系，筛选出白花败酱草抗结肠癌的活性成分，为复杂体系的中药药效物质基础的深入研究方法提供研究思路。

1 材料

1.1 细胞株

人结肠癌SW620 细胞[齐氏（上海）生物科技有限公司]。

1.2 试药

10 批白花败酱草样品采自不同省市，详细信息见表1，经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为

Patriniavllosa

的干燥全草。 槲皮素（批号：111595-201604）、 咖啡酸（批号：111915-201608）、绿原酸（批号：110715-201620）、阿魏酸（批号：111595-200301）、芦丁（批号：111701-200503）、槲皮苷（批号：110715-201620）、橙皮苷（批号：1521-200204）、木犀草素（批号：111701-200607）（对照品，纯度≥99%，中国食品药品检定研究院）；质谱级甲醇、乙腈（德国Merck 公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；甲酸（色谱纯，美国Thermo 公司，批号：141831A）；乙酸乙酯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；Hoechst33342/PI 试剂盒（碧云天生物技术研究所）；胎牛血清、胰蛋白酶（美国GIBCO 公司）；L-15 培养基（北京索莱宝科技有限公司，批号：20200910）；青霉素/链霉素溶液（Meilunbio 公司）；负性环氧树脂光刻胶SU-8 及显影液（美国Micro-Chem 公司）；Sylgard 184 型聚二甲基硅氧烷PDMS 及固化剂（美国Dow-Corning 公司）。

表1 10 批白花败酱草样品来源信息
Tab 1 Source information of 10 batches of

编号批号产地编号批号产地S120190828广西S620190519四川S220190817江苏S720200521内蒙S320200305湖北S820200722河南S420200416安徽S920200910江西S520200523河北S1020200729山东

1.3 仪器

LSP04-1A 型精密注射泵（保定兰格公司）；NIKON ECLIPSE TI 荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）；TG-2U 型光刻机（北京中科同志科技有限公司）；HPDC-32G-2 型等离子清洗机（Harrick Plasma 公司）；Agilent-1260Ⅱ高效液相色谱仪、Agilent 6550 UPLC-Q-TOF-MS 质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 不同产地白花败酱草乙酸乙酯部位指纹图谱的建立

2.1.1 供试品溶液的制备 称取各产地药材适量，以10 倍量60%乙醇回流提取2 次，放冷，滤过，合并提取液，回收乙醇至无醇味，加纯水稀释至质量浓度为0.1 g（生药量）·mL溶液，备用。再分别量取5 份100 mL 白花败酱草提取液，其中一份置于烧杯内，水浴浓缩至10 mL。5 份溶液分别置于分液漏斗中，各加入1∶1（

V/V

）的乙酸乙酯，轻轻振荡摇匀，静置分层，取上层溶液，水浴浓缩至10 mL，过0.22 μm 微孔滤膜，作为供试品溶液，4℃保存，备用。

2.1.2 色谱条件 Agilent poroshell SB-C（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0 ～55 min，5%～50%A），流速0.6 mL·min，柱温30 ℃，紫外检测波长254 nm，进样量5 µL。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液5 μL，连续进样6 次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差（

RSD

）。结果

RSD

值均小于1.0%，表明仪器精密度良好。2.2.2 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液5 μL，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样6 次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，结果其

RSD

均小于2.4%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。2.2.3 重复性实验 制备6 份供试品溶液，分别进样检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，结果其

RSD

均小于1.9%，表明方法重复性良好。2.2.4 指纹图谱的建立 取供试品溶液进样分析，得到10 个不同产地白花败酱草乙酸乙酯部位的指纹图谱，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版），见图1。10 批白花败酱草样品的相似度在0.946 ～0.997，表明10 批样品基本一致，见表2。从表2 可以看出，山东、河南、四川产样品相似度相对较低，其他样品相似度相对较高。从峰面积及保留时间

RSD

可以看出各峰保留时间差异较小，但峰面积差异较大，表明各成分含量有所差异，见表3。

图1 10 批不同产地白花败酱草的HPLC 指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprints of 10 batches of Patriniavllosa from different origins

表2 10 批白花败酱草相似度结果
Tab 2 Similarity of 10 batches of

产地相似度产地相似度广西0.999四川0.954江苏0.998内蒙0.985大别山0.978河南0.967安徽0.997江西0.998河北0.987山东0.946

2.3 白花败酱草乙酸乙酯部位抗结肠癌药效研究

2.3.1 细胞凋亡芯片的设计与制作 芯片采用实验室微流控技术，通过软光刻、模塑法以及氧等离子体键合三大技术手段制得。本实验构建一种多功能的高通量药物筛选芯片，分为上下两部分，依次为PDMS 流体通道层和玻璃基底层。主要通道包括流体通道区和细胞培养区，其中包括8 个入口、1 个废液出口；细胞培养区由8 列细胞培养腔组成，每列设置5 个复孔，每个培养腔为1.0 mm×1.2 mm 的椭圆形；8 组培养腔共用一个废液口（见图2）。

图2 微流控芯片示意图与实物图Fig 2 Schematic diagram and physical picture of microfluidic chips

2.3.2 细胞凋亡芯片的适用性实验 取对数生长期的SW620 细胞，调整密度为3×10个·mL接种于芯片中，待细胞贴壁后，将培养液以0.2 μL·min的流速经微量注射泵注入芯片中进行动态培养。细胞在芯片上分别培养24、36、48 h 后，用1∶100 稀释倍数的AO/EB 混合染色液进行染色，并使用荧光倒置显微镜进行拍照，见图3。通过Image J 软件的细胞计数功能计算芯片中细胞的存活率，细胞在芯片中的生长状态良好，细胞存活率均在96%以上。

图3 不同时间点空白组细胞生存情况Fig 3 Survival of cells in the blank group at different time points

2.3.3 体外药效学评价 待芯片中细胞密度在80%左右时，根据前期预实验结果，用含10%胎牛血清的SW620 培养液将“2.1.1”项下供试品配制成1.0 mg·mL的药液，经蠕动泵灌注入芯片，作用48 h 后停止给药。采用Hoechst33342/PI进行双染，使用倒置荧光显微镜进行拍照，通过Image J 软件计算其凋亡坏死率，结果各产地药材作用后细胞凋亡坏死率分别为95.4%（广西）、89.9%（江苏）、80.92%（大别山）、76.8%（安徽）、66.8%（河北）、60.8%（四川）、57.7%（内蒙）、55.3%（河南）、52.4%（江西）、50.2%（山东），见图4。

图4 Hoechst33342/PI 双染荧光检测结果（×100）Fig 4 Hoechst33342/PI double staining fluorescence detection（×100）

2.4 白花败酱草乙酸乙酯部位HPLC 色谱图与其抗结肠癌作用的谱效关系分析

2.4.1 灰色关联度分析 从表3 中选取分离度及对称性较好的峰进行标号，并对36 个峰进行灰色关联分析，见图5。采用Grey Modeling-V3.0 灰色关联度分析软件，将影响整体行为的数据进行分列，以细胞的凋亡坏死率为母序列，白花败酱草不同峰面积为子序列，对不同产地白花败酱草的色谱峰与药效进行灰色相对关联度分析，结果见表4。结果发现各共有峰与抗结肠癌药效均具有一定的关联性，且抗结肠癌作用是各种化学成分共同作用的结果，但是其中几种化学成分起主导作用。根据对结肠癌细胞凋亡坏死率的关联度相关系数大于0.7 的色谱峰有12 个，峰号以关联程度排序依次为10、4、19、5、24、26、25、2、3、23、13、14。

图5 白花败酱草乙酸乙酯部位HPLC 指纹图谱Fig 5 HPLC fingerprint of ethyl acetate extract of Patriniavllosa

表3 10 批白花败酱草峰面积及保留时间计算结果
Tab 3 Peak area and retention time of 10 batches of

峰号峰面积峰面积RSD/%保留时间RSD/%安徽河北大别山广西河南江苏江西内蒙山东四川10209.35800275.630001214.576543.754 1543.25634.50.070 20316.1580513.7880124.54700135.532178.36431.90.020 3435.275519.462364.145589.648467.046686.869797.483664.763947.250 1028.56158.00.040 4503.893554.477659.241748.625869.250949.054 1257.596 1227.333 1586.167 1680.62354.80.11 51035.056415.665 1276.483843.904 1293.250 1354.078 3165.438 3294.707 3673.410 3686.93647.21.3 6179.897092.679345.71200165.574178.689170.712010.90.050 70243.567211.456317.519149.537117.856316.5650260.176305.47856.20.090 8000163.357214.89700438.897271.51304.70.010 900437.56500365.79100171.513257.28919.20.11 10 1821.036350.575 2907.495 4599.940 1700.788 1181.181 1282.809951.057 2655.185 1460.41760.10.030 11208.959388.901118.417318.654 2157.654 2899.863 2286.136215.909 2398.705 2844.77210.60.090 12 1108.659 1236.357 1381.445 1930.763 1732.583 1331.647 1325.549 1210.258 1305.415 1377.22321.10.10 13208.959507.143384.579988.684280.774 1758.007496.574 1355.764238.492 1352.05964.20.090 14269.9860179.09800651.789411.89800216.5875.20.020 15137.533600.436219.247131.027409.483 1078.633959.184 1104.047 1385.586 1052.18431.70.60 16 2364.583 3671.573 3771.212 3924.493 5605.830 3098.115 2300.538 3425.569 6270.339 12 206.0208.40.050 17 2343.794 2594.736 3711.122 3220.446 4226.789 5228.353 4552.820 3169.885 5535.244 5368.31660.60.42 18000254.587158.784215.689147.673189.742333.120985.5433.90.010 190211.991328.14600378.41300513.053 1578.37833.10.070 200149.5130170.158211.111326.410470.015510.987314.537785.08759.80.030 21458.82089.11257.898365.78799.676093.90787.9080021.90.020 22586.954260.545 1125.159 3580.434130.055362.695 8121.811131.914282.518587.8051.40.020 230190.593000258.0910295.475219.089209.75326.80.22 24 1820.893446.486 1190.743306.579261.188450.543 6644.256233.327692.791649.54658.30.040 25 4284.496 1392.385 2384.389 17 739.483 1448.392 1459.483 2672.372 3478.389 1238.387 4906.40561.20.040 26101.5790076.34287.23559.9010135.723112.892039.90.010 2700150.129309.054218.981517.415425.493259.482346.897175.3878.40.010 28489.473804.980 1536.436 1869.398210.021 1113.647 1161.072153.489 3200.061 3560.95527.70.060 290208.378126.8930269.852106.02344.86500044.90.050 30 3524.019959.871 2031.129 6198.483 3534.961 5335.143 7600.940 8375.732 8830.062 9340.8384.70.020 31987.473555.837684.434 1516.473404.487264.864198.549354.473576.207856.59318.80.050 32 1284.837256.832456.473416.046871.739698.830367.092974.467687.193 1654.38674.40.050 3379.90473.986104.875072.097081.934113.9860013.70.020 34335.483356.596694.596475.968750.859760.976456.986769.956583.457843.24521.40.15 3500000146.7560240.902300.975159.37531.80.010 360100.9810201.002225.145298.567230.491205.873160.058323.09443.30.010 3799.984200.892149.93292.9020103.92300100.823060.80.10 38555.095758.596489.592645.483643.485576.696348.489684.234604.793945.4598.40.010 39000100.019236.594600.5780145.592354.589401.08934.50.13 400712.981000001357.483929.537721.0737.70.040 41100.7850089.87670.765121.098111.998077.763061.00.25 42211.270748.382 1531.807 2662.029802.691836.935336.065214.303817.731 1102.78278.80.12 43000159.09800527.057303.03378.973 1236.85344.10.010 44564.685383.968779.587643.583475.326984.346389.256343.594639.489985.5843.90.040 450175.1450140.1250290.124790.593505.857246.583987.69025.80.070 4600181.194209.0010183.414645.5780210.402509.7037.30.030

2.4.2 偏最小二乘法回归分析 为了进一步明确白花败酱草化学成分和药效之间的正负相关性，将表4 中关联系数大于0.7的各成分峰面积作为变量

X

，获取的不同产地白花败酱草乙酸乙酯部位的药效数据作为变量

Y

，导入SIMCA14.1 软件中，经UVN 标准化后，进行偏最小二乘法回归分析，OPLS-DA 模型中

R

X

＝0.798，模型预测参数

Q

＝0.81，均大于0.5，表明建立的模型有效稳定。通过偏最小二乘法进一步验证12 个峰与药效的相关性，得到其标准化回归系数图，见图6。除24 号峰，其余11 个峰均与药效均成正相关。

表4 不同产地白花败酱乙酸乙酯部位成分与药效指标的相关性分析
Tab 4 Correlation between composition in ethyl acetate extract of and efficacy of indicators from different origins

峰号关联系数峰号关联系数1 0.507 190.954 2 0.806 200.671 3 0.796 0.959 0.897 210.500 4 220.590 5 230.765 6 0.505 240.868 7 0.502 250.811 8 0.668 260.816 9 0.528 270.560 100.993 280.500 110.560 290.642 120.537 300.500 130.729 310.500 140.711 320.545 150.501 330.662 160.501 340.686 170.589 350.500 180.501 360.501

图6 回归系数（A）和VIP 值（B）分析结果Fig 6 Regression coefficient（A）and VIP value（B）analysis

为进一步确认贡献度较大的成分，采用变量载荷评价参数值（VIP）进行评价，该值可以体现变量对模型的整体贡献水平。VIP 值越大，表明变量的贡献程度越大，一般认为，VIP 值大于1的化合物发挥了重要作用。其中有8 个共有峰的VIP 值＞1，分别为23、26、14、10、4、3、2、25 号峰，表明这些峰与药效指标成较强的正相关（VIP ＞1）。结合现有文献对上述成分抗结肠癌的报道，初步确定这8 种成分为白花败酱草乙酸乙酯部位抗结肠癌作用的有效成分。

2.5 药效成分鉴定

2.5.1 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），采用正/负离子模式检测，干燥气体流速为13 L·min，干燥气体温度为225℃，毛细管电压为3500 V，雾化器压力为40 psi，碎裂电压为125 V，二级质谱碰撞电压为20 eV，

m/z

范围为50 ～1500。

2.5.2 成分鉴定 利用UPLC-Q-TOF-MS 对白花败酱草乙酸乙酯部位进行一级质谱和二级质谱采集。通过二级质谱的裂解，获得化合物的离子碎片，结合对照品和文献对“2.4.2”项下8 种药效成分进行快速鉴定，结果见表5。其中抗结肠癌活性较强的8 个成分分别为23（槲皮素）、26（木犀草素）、14（芦丁）、10（槲皮苷）、4（绿原酸）、3（水杨酸）、2（原儿茶酸）、25（野黄芩苷）。

表5 药效成分解析结果
Tab 5 Component analysis results of common peaks

注（Note）：为经对照品比对（means compared with the reference substance）。

峰号保留时间/min分子式离子模式实际值（m/z）理论值（m/z）误差碎片值化合物22.357C7H4O2[M－H]－155.0339 155.0344 －0.31 109.0303，91.6907原儿茶酸[12]32.726C7H6O3[M ＋H]＋139.0346 139.0394 －3.42 139.0893，110.9913，94.9352水杨酸[13]4*3.885C16H18O9 [M－H]－353.0801 353.0878 －2.10 191.0561，179.0356，173.0407，147.0610，161.0213 绿原酸10*5.756C21H20O11 [M ＋H]＋449.1032 449.1078 －1.02 303.0496，153.0541，137.0025槲皮苷14*7.899C27H30O16 [M ＋H]＋611.1606 611.1607 －0.02 465.1028，449.1078，303.0499，181.0131芦丁23*11.73C15H10O7 [M ＋H]＋303.0438 303.0499 －2.01 275.0553，257.0430，229.2394，193.0134槲皮素2512.430 C21H18O12 [M ＋H]＋463.0867 463.0871 －0.08 287.0730，269.0448，153.0217，123.0287野黄芩苷[14]26*12.707 C15H10O6 [M ＋H]＋287.0535 287.0552 －0.59 259.0601，231.0652，153.0177，135.0435木犀草素

2.6 白花败酱草单体成分体外抗结肠癌药效验证研究

根据上述结果，分别考察了广西产白花败酱草乙酸乙酯部位、槲皮素、芦丁、木犀草素、槲皮苷及4 种单体配伍组（按1∶1∶1∶1 配伍）体外抗结肠癌活性，按“2.3.3”项下方法进行细胞验证，结果见图7。在1.0 mg·mL质量浓度条件下，各组细胞凋亡坏死率分别为95.4%、78.6%、69.2%、62.5%、60.3%、82.9%，均达到60%以上。证明这4 个化合物都能够明显促进结肠癌细胞凋亡坏死，与筛选结果一致，从而证明了利用灰色关联及偏最小二乘回归模型相关分析推测药效成分的方法具有可行性。

图7 白花败酱草乙酸乙酯部位及活性单体成分验证Fig 7 Verification of ethyl acetate Patriniavllosa and active monomer components

3 讨论

随着显微荧光影像分析、图像数据处理等各项技术的不断发展与进步，微流控芯片技术在中药领域的应用具有巨大的发展潜力，本实验设计了单层结构的细胞凋亡芯片，并将其首次用于白花败酱药材的相关研究。蠕动泵在细胞可承受的剪切力条件下以0.2 µL·min的流速进行动态灌注，作用48 h 后的药液消耗量还不足0.6 mL，用量是传统96 孔板技术的百分之一，为稀有药材的体外药效实验提供了可行的方法。此外，芯片共用一个废液排出口，大大降低了实验的复杂性，节约了实验时间。

中药发挥治疗作用具有多成分、多靶点的特点，发挥药效是其多种成分共同作用的结果，指纹图谱的特征与药效存在一定的关联。指纹图谱反映的是药材提取物的整体特征，所以在保证整体的前提下，其色谱峰与药效关联起来建立谱效关系具有一定的实际意义。本实验将中药指纹图谱技术与微流控芯片技术相结合，建立了10种不同产地白花败酱乙酸乙酯部位的指纹图谱，并通过灰色关联度法进行初步分析，通过相关系数能直观判断各色谱峰相应成分与药效作用的相关性大小。偏最小二乘回归分析法可以直观显示色谱峰与药效指标的密切程度和正负程度。因此本文利用灰色关联度结合偏最小二乘回归分析法分析得出23（槲皮素）、26（木犀草素）、14（芦丁）、10（槲皮苷）、4（绿原酸）、3（水杨酸）、2（原儿茶酸）、25（野黄芩苷）为药效峰，并且8个色谱峰对体外药效学评价的影响较大，关联度均达到0.7 以上。针对其药效峰，本课题组采用UPLC-Q-TOF-MS 技术手段，进行分析并验证，结合相关文献调研说明这8 个成分对抑制结肠癌细胞增殖起到重要的作用，揭示了白花败酱草药材抗结肠癌作用的本质。

本研究建立了以药理药效为导向的研究方法，即保证了药效的合理性，也保证了药材的整体性及复杂性。综上所述，本实验基于微流控芯片技术，探讨白花败酱草乙酸乙酯部位抗结肠癌药效作用，不仅为微流控芯片技术在药物领域的应用扩宽了范围，也为深入研究白花败酱草药效物质基础提供了科学依据。