基于生物信息学筛选银杏叶中的促成骨活性成分

孙苗苗，梁鹏晨，周紫艳，唐晔翎，李田，梁冬雨，易清清*，常庆*（1.上海中医药大学研究生院，上海 0010；.上海健康医学院附属嘉定区中心医院临床科研中心，上海 01800；.中国药科大学研究生院，南京 11198）

骨质疏松是一种骨骼密度和质量降低的骨相关性疾病，患有骨质疏松的患者，骨折的风险会显著增加。骨质疏松症已成为世界范围内最常见和治疗昂贵的疾病之一。尽管目前使用二膦酸盐可以降低骨质疏松症患者的骨折风险，但其起效较慢，需要较长的治疗周期，且具有一定的风险，如胃肠道不耐受和颌骨坏死。而传统的中药具有不良反应少，价格低等特点，在治疗骨质疏松方面具有较好的研究价值。

银杏作为我国现存最早的孑遗植物，被称为“活化石”，目前被广泛用于治疗多种疾病。据报道，该植物的主要化合物为萜类化合物、银杏酸以及植物雌激素。银杏叶的提取物具有抗氧化，调节血管舒缩以及改善血液循环，防止组织缺血等多种功能，被广泛用于心血管疾病等方面。同时银杏叶还有治疗骨相关疾病的报道。研究发现银杏叶提取物可以改善糖皮质激素诱导的骨质疏松症大鼠的碱性磷酸酶和骨矿物质密度。但是银杏叶作为一种传统中药，成分复杂，发挥药效的成分不明确，因此明确银杏叶中促成骨作用活性成分具有重要意义。目前利用生物信息方法研究中药对疾病的作用机制比较成熟，因此本研究通过生物信息学对银杏叶中促成骨活性的成分进行筛选，同时初步探讨银杏叶在促成骨方面的作用机制。

1 方法

1.1 有效成分的筛选

通过TCMSP（中草药系统药理平台，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology）数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索银杏叶的化合物。本研究以药物相似度（DL）≥0.18为标准，并且排除没有CID（数字标识）号以及没有3D 结构的化合物，剩余的成分即为银杏叶中用于后续研究的促成骨活性成分。

1.2 分子对接

首先通过文献阅读查找骨相关蛋白，细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、转化生长因子-

β

激活激酶1（transforming growth factor-beta activated kinase 1，TAK1）、蛋白酪氨酸激酶-2

β

（protein tyrosine kinase-2 beta）， 利 用PDB（https：//www.rcsb.org）下载蛋白的3D 结构，采用 AutoDock Tools软件对删除水分子、添加氢原子、分离原配体，输出蛋白并保存为pdbqt 格式。从Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载相应化合物的3D 结构文件，并转换为pdbqt 格式。将蛋白中原配体的位置坐标，设置为对接的活性位点。利用Autodock Vina 软件，进行分子对接及结合自由能评价。促成骨相关蛋白信息见表1。

表1 促成骨相关蛋白信息
Tab 1 Promoting bone-related protein information

信号通路蛋白UniprotPDB 编号原配体MAPKERK1 ERK2 TAK1 38Z 36Q EDH BMPAKT1 AKT2 P27361 P28482 O43318 4QTB 4QP3 5V5N SMH G95其他Protein tyrosine kinase-2 beta P31749 P31751 3QKK 3E87 Q142893ET7349

1.3 化合物吸收、分布、代谢、排泄（ADME）的预测及筛选

药物与人体之间的相互作用是一个双向过程：药物影响人体，导致受体抑制，激活和信号通路阻断，人体通过ADME 来处置药物，所以研究药物的ADME 性质对研究药理活性具有重要意义。本文选取对接分数排名前20 的化合物进行ADME 的预测。将这些化合物3D 结构导入到Discover studio（2016）中ADMET 板块，在“small molecules（小分子）”模块中选定“calculate molecular properties（计算分子性质）”点击 “ADMET descriptors” 进行参数设置，点击运行，对化合物的ADME 进行预测，获得这些化合物的被动肠内吸收性、25 ℃ 以下的水溶性、人细胞色素 P450 2D6 酶结合（CYP2D6 binding）、肝毒性、血浆蛋白结合等方面的数据。

1.4 毒性预测

本研究将对接结果得分之和排名前20 的化合物放在Discover studio 软件中TOPKAT 板块进行毒性预测，在“small molecules”模块中选定“calculate molecular properties”点击 TOPKAT descriptors（毒性描述）进行参数设置，点击运行，分析结果。

1.5 体外成骨活性评价

MC3T3-E1 细胞（小鼠胚胎成骨前体细胞）用含 10%胎牛血清的MEM 培养基（含100 IU·mL青霉素、100 μg·mL链霉素），在37 ℃、5%CO、饱和湿度条件下培养至细胞生长至 70%～80%开始传代，进行后续实验。调整细胞浓度为5×10个·mL，每孔体积100µL，接种于96 孔中24 h 后，分成7 组分别给予药物干预，分别为对照组（含有5%血清的MEM培养基），二甲基亚砜（DMSO）组，药物组（2.30、4.61、13.87、9.23、18.46 mol·L胡萝卜苷），每组3 个复孔，放入37℃培养24 h 后，每孔加入CCK-8 试剂10 µL，继续放入培养箱孵育1 h，在450 nm 波长下用酶标仪测定每孔吸光度（

OD

）值。

1.6 实时定量PCR（qRT-PCR）

实时定量PCR 检测TAK1、AKT1 mRNA 相对表达量。

不同浓度的胡萝卜苷（0、2.30，4.61 mol·L）处理MC3T3-E1 细胞3 d，使用Trizol、氯仿、乙醇及DEPC 水等抽提总RNA，所有的操作均在冰上进行，然后根据试剂说明书进行RNA 的逆转录过程。37℃，15 min，85℃ 5 s 进行逆转录。扩增条件：95℃预变性30 s，95℃变性3 s，60℃退火30 s，共40 个循环，以GAPDH 为内参，目的基因相对表达量采用2法。引物序列见表2。

表2 qRT-PCR 引物扩增序列
Tab 2 Amplification of gene primers by real-time quantitative PCR

基因名称引物序列（5-3'）产物大小/bp TAK1 上游ATTCCACAGATACCAATGGCTC22下游TGTAGTAACAATGCGATTTCGG AKT1 上游CCGGAATTCAGCGACGTGGCTATTGTGA 28下游CCGCTCGAGGGCCGTGCGCTGGCCGAG GAPDH 上游CCTCGTCCCGTAGACAAAAATG21下游TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT

2 结果

2.1 银杏叶中的有效成分筛选结果

通过TCMSP 数据库检索银杏叶中的有效成分，共获取307 个成分，通过DL ≥0.18 为标准，筛选后获得木犀草素-4'-葡萄糖苷，山柰酚-7-鼠李糖苷，没食子儿茶素等86 个有效成分，排除没有CID 号的化合物之后剩余72 个化合物，再排除有3D 结构的化合物，剩余55 个化合物（见表3，用于后续的研究）。

表3 银杏叶筛选后的主要活性成分
Tab 3 Main active ingredients of ginkgo biloba after screening

Mol ID化合物英文名称化合物中文名称相对分子量 DL MOL011597 luteolin-4'-glucoside木犀草素-4'-葡萄糖苷448.410.79 MOL008436 kaempferol-7-rhamnoside山柰酚-7-鼠李糖苷432.410.73 MOL011584 （－）-gallocatechin没食子儿茶素594.560.61 MOL011580 chrysoeriol 7-glucoside大黄素-7-葡萄糖苷462.440.82 MOL002035 kaempferol 7-O-glucoside山柰酚7-O-葡萄糖苷448.410.76 MOL002692 5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）-3-[（2S，3S，4S，5S，6R）-3，4，5-trihydroxy-6-（hydroxymethyl）tetrahydropyran-2-yl]oxy-chromen-4-one 5，7-二羟基-2-（4-羟基苯基）-3-[（2S，3S，4S，5S，6R）-3，4，5-三羟基-6-（羟甲基）四氢吡喃-2-基]氧基色-4-酮448.410.74 MOL000357 daucosterol胡萝卜苷576.950.62 MOL003686 narcissoside水仙苷624.60.65 MOL007179 linolenic acid ethyl ester亚麻酸乙酯306.540.2 MOL010972 quercitrin-2'-gallate槲皮苷-2'-没食子酸酯600.520.68 MOL011569 5-methoxy-bilobetin5-甲氧基-胆碱582.540.6 MOL002693 nicotiflorin烟碱594.570.73 MOL007260 isorhamnetin-3-O-glucoside异鼠李素-3-O-葡萄糖苷478.440.8 MOL002511 isoginkgetin异豆角蛋白566.540.58 MOL011052 anacardic acid C羽扇豆酸C344.540.32 MOL008906 hydroginkgolinic acid氢化银杏酸334.550.27 MOL004362 afzelin山柰酚3-鼠李糖苷432.410.7 MOL004401 bilobetin胆红素552.510.63 MOL009278 laricitrin大黄素332.280.34 MOL011604 syringetin丁香脂素346.310.37 MOL011051 ginkgoic acid银杏酸346.560.32 MOL011585 cardanol monoene腰果酚单烯302.550.21 MOL011054 5-（8Z-pentadecenyl）resorcinol5-（8Z-十五碳烯基）间苯二酚318.550.24 MOL002083 5，7，4'-trihydroxy-3'，5'-dimethoxyflavone5，7，4'-三羟基-3'，5'-二甲氧基黄酮330.310.34 MOL009292 tricetin甘油三酸酯302.250.28 MOL011550 amentoflavone-7，4'，4'''-trimethyl ether黄酮7，4'，4'''-三甲基醚580.570.54 MOL002008 myricetin杨梅素318.250.31 MOL000354 isorhamnetin异鼠李素316.280.31 MOL005573 4'，5-dihydroxy-7-methoxyflavone4'，5-二羟基-7-甲氧基黄酮284.280.24 MOL002881 luteolin 4'-methyl ether木犀草素4'-甲基醚300.280.27 MOL002037 amentoflavone黄酮538.480.65 MOL002680 flavoxanthin毛莨黄素584.960.56 MOL000422 kaempferol山柰酚286.250.24 MOL000415 rutin芸香苷610.570.68 MOL000437 hirsutrin头孢菌素464.410.77 MOL000449 stigmasterol豆甾醇412.770.76 MOL000007 apigenin 7-glucoside芹菜素7-葡萄糖苷432.410.74 MOL003044 chryseriol金丝桃醇300.280.27 MOL000701 quercitrin槲皮苷448.410.74 MOL000006 luteolin木犀草素286.250.25 MOL000008 apigenin芹菜素270.250.21 MOL000098 quercetin槲皮素302.250.28 MOL002509 ginkgetin银杏素566.540.59 MOL001955 chlorogenic acid绿原酸354.340.33 MOL000358 beta-sitosterolβ-谷甾醇414.790.75 MOL005043 campesterol菜油甾醇400.760.71 MOL011050 anacardic acid没食子酸348.580.31 MOL011062 6-tridecylsalicylic acid6-十三烷基水杨酸320.520.23 MOL000096 （－）-catechin（－）-儿茶素290.290.24 MOL006791 epigallocatechin表没食子儿茶素306.290.27 MOL008317 hydroginkgol氢化甘油304.570.21 MOL002249 gallocatechin儿茶素306.290.27

续表3

Mol ID化合物英文名称化合物中文名称相对分子量 DL MOL005805 pyreneβ-芘202.260.19 MOL002681 fluoranthene荧蒽202.260.18 MOL000492 （＋）-catechin（＋）-儿茶素290.290.24

2.2 分子对接结果分析

经过文献搜索最终选取ERK1，ERK2，TAK1，AKT1，AKT2、Protein tyrosine kinase-2 beta 六种成骨蛋白作为主要靶点，将从银杏叶中筛选出来的木犀草素4'-葡萄糖苷，山柰酚7-鼠李糖苷等55 个有效成分与上述6 种成骨相关蛋白进行对接，每个分值与原配的相对得分越小，说明化合物与蛋白对接的稳定性越好。从图1、2 可以看到对接成功及结果较好的有黄酮（5281600），银杏素（5271805）等53 个化合物。这些化合物中有些在骨研究方面有报道。研究发现槲皮素可以通过调节有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路来减轻卵巢切除大鼠的骨质疏松；山柰酚可以通过调节雌激素受体、BMP-2 等信号通路来实现抗骨质疏松的作用。图1 选取了其中一个蛋白中对接分数较好的前几个化合物进行展示。通过图1 说明，银杏叶中的化学成分的确含有跟骨相关蛋白对接的化合物，进一步来证实存在成骨的活性成分。

图1 分子-蛋白残基作用力示图Fig 1 Molecule-protein residue force diagram

2.3 ADME 结果分析

本研究利用DS2016 对化合物进行ADME的预测，结果见表4。从表中可以看到水溶性较好的化合物为大黄素-7-葡萄糖苷（11294177），芹菜素-7-葡萄糖苷（5280704），木犀草素-4'-葡萄糖苷（26235513），山柰酚7-

O

-葡萄糖苷（10095180）等六种糖苷类化合物；肠内吸收性较好的是

β

-芘（31423），芝麻素（72307）；可作为人细胞色素P450 2D6 酶结合（CYP2D6 binding）的非抑制剂5-甲氧基-胆碱（5319411），黄酮（5281600），

β

-芘（31423），芝麻素（72307）；没有肝毒性的是木犀草素-4

'

-葡萄糖苷（26235513），

β

-谷甾醇（222284），菜油甾醇（173183），豆甾醇（5280794），胡萝卜苷（5742590）等。

表4 银杏叶中有效成分ADME 预测结果
Tab 4 ADME prediction results of selected components in ginkgo biloba

血浆蛋白结合11294177 chrysoeriol 7-glucoside大黄素-7-葡萄糖苷好不确定抑制剂非常不好 有毒强5280704 apigenin 7-glucoside芹菜素-7-葡萄糖苷好不确定抑制剂非常不好 有毒强26235513 luteolin-4'-glucoside木犀草素-4'-葡萄糖苷好不确定抑制剂非常不好 无毒强222284beta-sitosterolβ-谷甾醇极低 不确定抑制剂非常不好 无毒弱10095180 kaempferol 7-O-glucoside山柰酚-7-O-葡萄糖苷好不确定抑制剂非常不好 有毒强5319411 5-methoxy-bilobetin5-甲氧基-胆碱很低 不确定非抑制剂非常不好 有毒弱25079965 kaempferol-7-rhamnoside山柰酚-7-鼠李糖苷好不确定抑制剂非常不好 有毒强5280459 quercitrin槲皮苷好不确定抑制剂非常不好 有毒强5281696 amentoflavone-7，4'，4'''-trimethyl ether 黄酮7，4'，4'''-三甲基醚 很低 不确定抑制剂不好有毒弱173183campesterol菜油甾醇很低 不确定抑制剂非常不好 无毒弱5280794 stigmasterol豆甾醇很低 不确定抑制剂非常不好 无毒弱5318569 isoginkgetin异豆角蛋白很低 不确定抑制剂非常不好 有毒弱5271805 ginkgetin银杏素很低 不确定抑制剂非常不好 有毒弱5281600 amentoflavone黄酮很低 不确定非抑制剂非常不好 有毒强5318767 nicotiflorin烟碱低不确定抑制剂非常不好 有毒强31423pyreneβ-芘很低 极高的渗透性非抑制剂好有毒弱5280805 rutin芸香苷很低 不确定抑制剂非常不好 有毒强5742590 daucosterol胡萝卜苷低不确定抑制剂不好无毒强72307sesamin芝麻素低中等抑制剂好有毒弱化合物化合物英文名称化合物中文名称水溶性水平血脑屏障水平细胞色素P450 2D6 水平人体肠道吸收水平肝毒性

图2 分子对接相对得分热图Fig 2 Relative score heat map of molecular docking

2.4 毒性预测结果

对分子对接排名前20 的化合物进行毒性预测，结果见表5，可知豆甾醇（5280794）和胡萝卜苷（5742590）相对于其他成分具有较低的致突变性、啮齿动物致癌性和发育毒性潜力以及大鼠口服利用度较好。其中胡萝卜苷的毒性最小，说明其在药物的应用方面具有较好的潜力。尽管胡萝卜苷的水溶性较差，现如今随着生物材料作为药物载体的发展，选择合适的药物载体将有利于改善药物溶解性差等问题。故结合ADME 的结果，选择胡萝卜苷进行后续实验。

表5 银杏叶中有效成分毒性预测结果
Tab 5 Toxicity prediction of selected components in ginkgo biloba

注：1.＜0.3（无致突变性），＞0.7（致突变）；2.＜0.3（非致癌物）， ＞0.7（致癌物）；3.＜50 mg·kg（高毒性），50 mg·kg ＜ ＜500 mg·kg（中等毒性），0.5 g·kg ＜ ＜5 g·kg（低毒性），5 g·kg ＜ ＜15 g·kg（实际上无毒性），＞15 g·kg（无毒性）；4.＜0.3（无毒）；＞0.7（有毒）。
Note：1.＜0.3（non-carcinogen），＞0.7（carcinogen）；2.＜0.3（non-mutagen），＞0.7（mutagen）；3.＜50 mg·kg（high toxicity），50 mg·kg ＜ ＜500 mg·kg（moderate toxicity），0.5 g·kg ＜ ＜5 g·kg（low toxicity），5 g·kg ＜ ＜15 g·kg（actually，non-toxic），＞15 g·kg（non-toxic）；4.＜0.3（non-toxic），＞0.7（toxic）.

化合物CID致突变1致癌性小白鼠2 致癌性大鼠2 大鼠口服利用度3/（g·kg－1）发育毒性4雄性雌性雄性 雌性11294177 0.901 1.000 0.979 0.966 0.0021.200 1.000 5280704 0.167 1.000 0.414 0.070 0.0001.500 1.000 26235513 0.927 1.000 0.473 0.087 0.0002.200 1.000 2222840.000 0.014 0.000 0.000 1.000333.200 0.966 10095180 1.000 0.000 0.164 1.000 0.075569.900 1.000 5319411 0.000 1.000 0.998 1.000 0.000338.200 1.000 25079965 0.998 1.000 0.023 0.416 0.00093.900 1.000 5280459 1.000 1.000 0.064 0.388 0.000113.700 1.000 5281696 0.000 1.000 0.893 1.000 0.000149.500 1.000 1731830.000 0.000 1.000 0.038 0.000321.500 0.961 5280794 0.000 0.000 1.000 0.012 0.000149.300 0.000 5318569 0.000 1.000 0.998 1.000 0.000262.800 1.000 5271805 0.000 1.000 0.999 1.000 0.000264.200 1.000 5281600 0.000 1.000 0.914 1.000 0.000627.200 1.000 5318767 1.000 1.000 0.0060.110 0.999174.700 1.000 314230.023 0.000 0.999 0.058 1.0002.900 0.966 5280805 1.000 1.000 0.009 0.138 1.000228.500 1.000 5742590 0.000 0.000 1.000 0.000 0.000358.600 0.010 723070.000 1.000 0.868 0.000 1.00015.600 0.888 5315459 0.000 1.000 1.000 1.000 0.000459.100 1.000

2.5 胡萝卜苷与蛋白对接结果

胡萝卜苷与蛋白受体具有较好的对接活性。与AKT2 蛋白对接自由能－10 kcal·mol，AKT1蛋白对接自由能－9.4 kcal·mol，Protein tyrosine kinase-2 beta 蛋白对接自由能－9 kcal·mol，EPK2 蛋白对接自由能－7.9 kcal·mol，EPK1 蛋白对接自由能－9.5 kcal·mol，TAK1 蛋白对接自由能－7.7 kcal·mol。经过对接笔者发现胡萝卜苷与这些蛋白的结合自由能小于－7 kcal·mol，可能具有较好的促成骨活性，胡萝卜苷与受体AKT2 蛋白和ERK1 蛋白对接示意图见图3、4。

图3 胡萝卜苷和AKT2 蛋白分子对接示意图Fig 3 Molecular docking of daucosterol and AKT2 protein

图4 胡萝卜苷和 ERK1 蛋白分子对接示意图Fig 4 Molecular docking of daucosterol and ERK1 protein

2.6 体外成骨活性的检测

如图5结果显示，成骨细胞培养细胞24 h 后，胡萝卜苷在2.30 mol·L时， 对MC3T3-E1细胞具有明显的促进作用（

P

＜0.0001），在4.61 mol·L时具有增殖效果（

P

＜0.05），在13.87 ～18.46 mol·L时对成骨细胞具有增殖趋势。

图5 胡萝卜苷对成骨MC3T3-E1 细胞增殖的影响Fig 5 Effect of daucosterol on the proliferation of osteoblast MC3T3-E1 cells

2.7 胡萝卜苷对TAK1、AKT1 mRNA 表达水平的影响

与对照组相比，胡萝卜苷在4.61 mol·L时对TAK1、AKT1 mRNA 表达量有显著的促进作用（

P

＜0.05），如图6 所示。该实验验证了分子对接时胡萝卜苷通过MAPK 信号通路和BMP信号通路促成骨的作用机制。

图6 胡萝卜苷促进TAK1、AKT1 mRNA 的表达Fig 6 Effect of daucosterol on the expression of TAK1 and AKT1 mRNA

3 讨论

本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）对银杏叶中的成分进行了筛选，共获得86 种有效成分。选取骨质疏松相关MAPK信号通路中的蛋ERK1、ERK2、TAK1 和BMPs信号通路蛋白AKT1、AKT2、以及其他通路上的蛋白Protein tyrosine kinase-2 beta 蛋白。其中丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）是一种丝氨酸蛋白激酶，三个主要家族是细胞外信号调节激酶（ERK）家族，p38 激酶家族和c-Jun N 末端激酶（JNK）家族，每个家族都由各自的亚家族组成，参与多种细胞活动相关的细胞内信号传导，可响应各种刺激（包括激素、化学物质和压力），将信号从细胞表面传递到细胞核，参与细胞增殖、存活、分化。据报道，有研究成骨细胞的基因表达和功能与MAPK 信号的刺激有关，并且有研究发现MSC来源的外来体通过MAPK 途径促进成骨细胞的增殖而改善骨质疏松症。此外与骨质疏松相关的信号通路BMP 骨形态发生蛋白可以与一些成骨转录因子，例如Dlx3，Dlx5 和Runx2相互作用，从而对促进间充质干细胞对成骨细胞产生影响，并且指导它们分化为成骨细胞。其中BMP-2（骨形态发生蛋白）刺激的成骨细胞分化需要胰岛素样生长因子（IGF）激活途径的持续信号传递，而AKT2是IGF调节成骨的关键介质。AKT 是成骨细胞中可以控制成骨细胞和破骨细胞分化的独特信号传导中间产物，在没有AKT1的情况下减少成骨细胞的生长。本文选取MAPK 信号通路中的蛋白ERK1、ERK2、TAK1、BMP 信号通路上的蛋白AKT1、AKT2、以及其他通路上的蛋白Protein tyrosine kinase-2 beta 蛋白进行分子对接，并且我们选取其中的一个蛋白ERK1 与化合物槲皮素、豆甾醇、黄酮、胡萝卜苷对接进行了展示。从分子对接的结果可知，成骨蛋白ERK1 与槲皮素作用力为疏水作用和氢键，其中相互作用的关键氨基酸位点是Asp184（B），ERK1 与豆甾醇作用力为疏水作用和氢键。ERK1与黄酮为疏水作用和氢键，其中相互作用的关键氨基酸位点是Lys71（B），Ser170（B）。ERK1 和胡萝卜苷受体结合的作用力为疏水作用和氢键，其中相互作用的关键氨基酸位点是As p166（B），Vac205（B），Arg84（B）。

通过ADME 毒性实验、qRT-PCR 评价所选化合物的药理性质。在药物研究中，其溶解度至关重要，药物只有先溶于水才能通过吸收进入生物膜，并且药物的溶解性影响药物的药理和毒性。药物毒性在药物临床应用方面具有非常重要的作用，低毒性的药物能够保证在应用方面的安全性，提高药物在临床上的成功率。本研究对化合物毒性进行预测，发现胡萝卜苷相对于其他的化合物具有较低的毒性，并且大鼠口服利用度较好。尽管水溶性较差，但作为一种亲脂性分子，更容易通过细胞膜进行吸收。此外胡萝卜苷通过血脑屏障能力还不确定，有待进一步研究。在本课题组中主要是研究药物载体，胡萝卜苷低毒性的优点，使我们将目标放在了胡萝卜苷上，因此，通过实验进一步来研究胡萝卜苷的成骨能力，为后续课题组的研究提供了新的方向。通过体外实验进一步验证，银杏叶中胡萝卜苷具有促成骨的活性，并且作用机制为促进MAPK 信号通路中TAK1 mRNA 的表达和BMP 信号通路中AKT1 mRNA 的表达。

4 结论

本文利用生物信息学的方法对银杏叶中的促成骨活性成分进行筛选，通过进一步对这些活性成分进行分子对接，ADME、毒性预测以及相关的实验验证，最终发现银杏叶中的胡萝卜苷具有较好的促成骨活性。更好地挖掘了银杏叶中的有效成分在治疗骨疾病方面的潜力，也为在治疗骨疾病方面提供了一种新的中药单体，为后续研究银杏叶在促成骨方面的机制方面提供了新的选择，更好地发挥中医药单体的作用，进一步促进中医药的发展。