刺苞老鼠簕的化学成分及其抗炎和抗氧化活性研究

2022-03-29贾慧珍鲁建美许又凯

天然产物研究与开发 2022年3期

贾慧珍，孙朋，鲁建美，吴敏，许又凯

1中国科学院西双版纳热带植物园热带植物资源可持续利用重点实验室，勐腊 666303；2中国科学院大学，北京 100049

爵床科(Acanthaceae)约有229属，3 450种[1]。我国约有68属311种，以云南地区种类最多。老鼠簕属(Acanthus)全球有30余种，其中有三种分布在中国，分别为老鼠簕Acanthusilicifolius，刺苞老鼠簕A.lecucostachyus和小花老鼠簕A.ebracteatus。在泰国传统医药中，老鼠簕属植物常被用作泻下、抗炎、治疗风湿性关节炎、退热、抗脓肿、抗溃疡等，其叶子被用于治疗风湿病、蛇咬、麻痹和哮喘，也可与胡椒一起作为滋补剂使用[2]。刺苞老鼠簕A.lecucostachyus，又名蛤蟆花，产云南南部且主要分布于西双版纳海拔550～1150米的密林中潮湿处，中南半岛及印度也有分布[3]。傣名为“帕夯喃”，是传统的傣药，在多部傣医药经书中均有记载[4,5]，主要用于治疗肾结石。据《中国傣药志》[4]中记载刺苞老鼠簕气微，味淡，凉，入水、土塔，归肾、膀胱经，全草入药具有清热解毒，利尿化石的功效，并与盾翅藤、水红木和肾茶等共同煎服治疗慢性肾炎。傣医使用刺苞老鼠簕治疗疾病已有上千年历史，并有明确疗效，已收入2005年版第三册傣族药《云南省中药材标准》[5]中的法定药材，是傣医常用草药之一，具有重要的药用价值。Huo等[6]综述国内外老鼠簕属植物的化学成分多为木脂素类、苯乙醇苷类、黄酮类、三萜类等。Babu等[7]通过药理实验表明老鼠簕叶子具有抗氧化和抗肿瘤等活性。虽然刺苞老鼠簕已列为云南省法定药材，但《云南省中药材标准》[5]只做了药材的生药鉴定和薄板层析等，刺苞老鼠簕的化学成分和药理活性仍为空白。因此，本文对刺苞老鼠簕的化学成分进行了研究，并对其化合物进行抗氧化和抗炎活性筛选，为刺苞老鼠簕的药用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

AVANCE III 500MHz核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；Avance III 600MHz核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司)；UPLC-IT-TOF液相-离子阱飞行时间色谱质谱联用仪(岛津制作所)；多功能荧光酶标仪+摇床Varioskan Flash(美国Thermofisher)；Waters 600型高效液相色谱仪配备Waters 2996二极管阵列紫外检测器(美国Waters公司)，色谱柱为YMC-Pack ODS-A(300 mm×10 mm，S-5 μm)半制备柱(TMS作内标)；柱层层析硅胶(200～300目)和GF254薄层色谱硅胶购自青岛海洋化工厂分厂；薄层层析硅胶(10～40 μm)购自青岛美高化工有限公司；Sephadex LH-20(40～70 μm)购自瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；EYELA油浴锅OSB-2100 和旋转蒸发仪N-1100(上海爱朗仪器有限公司)；倒置生物显微镜NIB-100(宁波永新光学股份有限公司)；台式离心机TDL-40B(上海安亭科学仪器厂)；生物安全柜BSC-1100IIB2-X 和CO2细胞培养箱QP-80(济南鑫贝西生物技术有限公司)；小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7(中科院上海细胞库)；DMEM培养基和胎牛血清(BI公司)；Griess Reagent、LPS及对照药物L-NMMA(Sigma公司)；乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、石油醚、浓硫酸等试剂均为分析纯购自天津市大茂化学试剂厂。

刺苞老鼠簕全草A.lecucostachyus于2019年8月采自于云南省西双版纳傣族自治州勐腊县勐腊镇补蚌村，经中科院西双版纳热带植物园肖春芬高级实验员鉴定，标本(No.60099)存放于中科院西双版纳热带植物园标本馆。

1.2 实验方法

1.2.1 提取分离

取干燥的刺苞老鼠簕全草3.8 kg，粉碎，室温下用甲醇浸泡浸提3次(七天/次)，合并提取液，滤过，减压浓缩得总浸膏515 g。将总浸膏加适量纯水混匀，使其充分溶解，用乙酸乙酯萃取8次，减压浓缩得到乙酸乙酯部位(186 g)。乙酸乙酯部位经大孔树脂(纯水、30%、60%、90%、丙酮)洗脱，得到5个组分(Fr.1～5)。Fr.3经硅胶(200～300目)柱色谱(二氯甲烷-甲醇梯度)洗脱后，得到3个部分(A.1、A.2、A.3)，其中A.1经薄层层析硅胶柱色谱，反复硅胶柱色谱(石油醚-乙酸乙酯梯度)洗脱以及重结晶得到化合物1(461.8 mg)。A.2经反复硅胶柱色谱，再经SephadexLH-20凝胶柱色谱分离纯化，甲醇洗脱，得到化合物2(1.3 mg)。A.3经硅胶柱(200～300目)分离，再经硅胶柱(10～40 μm)分离，用不同溶剂体系(二氯甲烷-甲醇，石油醚-乙酸乙酯)洗脱，得到化合物3(2.6 mg)、4(13.5 mg)和5(13.0 mg)。A.3组分经反复硅胶柱色谱得到化合物6(9.0 mg)和7(1.6 mg)。Fr.4经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇)洗脱，洗脱物经SephadexLH-20凝胶色谱，TLC检测合并相同部分，再经薄层层析硅胶柱色谱洗脱得到化合物8(2.8 mg)和9(45.7 mg)，过半制备HPLC(乙腈-纯水40∶60)分离得到化合物10(12.5 mg)。Fr.2经硅胶柱(200～300目)色谱分离，TLC检测并合并相同馏分，经反复硅胶柱色谱层析分离，得到化合物11(6.8 mg)、12(5.9 mg)和13(2.9 mg)。

1.2.2 活性筛选

通过DPPH自由基清除实验对分离得到的化合物进行抗氧化活性筛选，准备好与化合物对应的EP管，终浓度为100 μM，在96孔板进行分组，每组设置三个复孔，空白对照组加入100 μL无水乙醇，实验组加入100 μL待测化合物，将DPPH工作液分别加入96孔板分组中，避光反应30 min后，在517 nm处测吸光值。

将RAW 264.7细胞接种在96孔板，用1 μg/mL LPS进行诱导刺激，同时加入待测化合物处理至50 μM，设置不含药物组和L-NMMA阳性药物组为对照。对细胞进行培养后，取培养基检测NO生成，在570 nm处测定吸光值。在剩余的培养基加入MTS进行细胞存活率检测，排除化合物毒性影响。

NO生成抑制率=(OD非药物处理组-OD样品组)/

OD非药物处理组× 100%

2 实验结果

2.1 结构鉴定

图1 化合物1～13的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-13

化合物1白色粉末，可形成晶体(甲醇);EI-MS：m/z136 [M+H]+，分子式为C7H5NO2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.21～7.18(1H，m，H-7)，7.14(1H，dd，J= 7.6，1.0 Hz，H-4)，7.10(1H，dd，J= 7.8，1.2 Hz，H-6)，7.06(1H，dd，J= 4.7，4.1 Hz，H-5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：157.2(C-2)，123.4(C-4)，110.9(C-5)，110.7(C-6)，125.1(C-7)，131.6(C-8)，145.4(C-9)。以上数据与文献[8]基本一致，故鉴定为2-苯并噁唑啉酮(结构见图1)。

化合物2浅黄色晶体(甲醇);ESI-MS：m/z176 [M+H]+、174 [M-H]-，分子式为C10H9NO2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.23(1H，s，H-2)，8.19(1H，d，J= 8.0 Hz，H-4)，7.45(1H，d，J= 8.0 Hz，H-7)，7.22(2H，s，H-5，H-6)，4.72(2H，s，H-9)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：195.8(C-8)，137.9(C-7a)，134.1(C-2)，127.1(C-3a)，124.3(C-6)，123.3(C-5)，122.7(C-7)，115.0(C-4)，113.0(C-3)，65.7(C-9)。以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为3-羟基乙酰基吲哚。

化合物3无色针晶(甲醇);ESI-MS：m/z109 [M-H]-，分子式为C6H6O2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.75(2H，m，H-3，H-5)，6.65(2H，m，J= 9.5，3.5 Hz，H-4，H-6)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：146.4(C-1，C-2)，120.9(C-4，C-5)，116.4(C-3，C-6)。以上数据与文献[10]基本一致，故鉴定为儿茶酚。

化合物4白色片状结晶(甲醇);ESI-MS：m/z167 [M-H]-，分子式为C8H8O4。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.57(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2)，7.47(1H，dd，J= 8.2，1.9 Hz，H-6)，6.75(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5)，3.87(3H，s，-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：175.6(C = O)，150.1(C-3)，148.2(C-4)，130.5(C-6)，124.1(C-1)，115.0(C-2)，114.2(C-5)，56.4(-OCH3)。以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为香草酸。

化合物5无色粉末;EI-MS：m/z169 [M+H]+，分子式为C8H8O4。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.54(1H，dd，J= 8.2，1.9 Hz，H-6)，7.52(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2)，6.82(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5)，3.88(3H，s，-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：170.0(C = O)，152.7(C-1)，148.7(C-3)，125.2(C-6)，123.1(C-4)，116.0(C-2)，113.90(C-5)，56.4(-OCH3)。以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为methyl 3,4-dihydroxy-benzoate。

化合物6淡黄色粉末;ESI-MS：m/z138 [M+H]+，分子式为C7H7NO2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.27(1H，s，H-8)，7.97-7.92(1H，dd，J= 8.1，1.3 Hz，H-5)，6.97-6.92(1H，dt，J= 1.5，8.1 Hz，H-3)，6.83(1H，dd，J= 8.1，1.3 Hz，H-4)，6.80-6.76(1H，dt，J= 8.1，1.5 Hz，H-2)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：161.9(C-8)，148.6(C-4)，126.8(C-5)，126.2(C-2)，122.6(C-1)，120.4(C-6)，116.3(C-3)。以上数据与文献[12]基本一致，故鉴定为N-(2-hydroxyphenyl) formamide。

化合物7白色粉末;ESI-MS：m/z168 [M+H]+，分子式为C12H9N。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.05～8.01(2H，dt，J= 8.1，0.9 Hz，H-1，H-9)，7.42(2H，dt，J= 8.1，0.9 Hz，H-3，H-12)，7.34(2H，ddd，J= 8.2，7.1，1.2 Hz，H-4，H-11)，7.13(2H，ddd，J= 8.0，7.1，1.0 Hz，H-5，H-10)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：141.5(C-2，C-13)，126.7(C-7，C-8)，124.3(C-4，C-11)，121.1(C-1，C-9)，119.5(C-5，C-10)，111.7(C-3，C-12)。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定为咔唑。

化合物8无色油状物;ESI-MS：m/z279[M+H]+，分子式为C16H22O4。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.68～7.65(2H，m，H-2，H-5)，7.56(2H，dt，J= 5.8，2.9 Hz，H-3，H-4)，4.23(4H，t，J= 6.6 Hz，H-13，H-16)，1.71～1.62(4H，m，H-14，H-15)，1.44～1.3(4H，m，H-17，H-20)，0.93(6H，t，J= 7.1 Hz，H-18，H-19)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：169.3(C-7，C-10)，133.6(C-1，C-2)，132.4(C-4，C-5)，129.9(C-3，C-6)，66.7(C-13，C-16)，31.7(C-14，C-15)，20.3(C-17，C-20)，14.1(C-18，C-19)。以上数据与文献[14]基本一致，故鉴定为邻苯二甲酰正二丁酯。

化合物9无色针晶;ESI-MS：m/z207 [M+H]+，分子式为C12H14O3。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.68(2H，d，J= 10 Hz，H-2，H-6)，6.89(3H，m，overlapped，H-1′，H-3，H-5)，5.81(1H，d，J= 12.8 Hz，H-2′)，4.16(2H，q，J= 7.1 Hz，H-1′′)，3.80(3H，s，-OCH3)，1.25(3H，t，J= 7.1 Hz，H-2′′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：168.4(C-3′)，161.8(C-4)，144.3(C-1)，133.3(C-1′)，117.8(C-2，C-6)，114.2(C-3，C-5)，61.1(C-1′′)，55.8(-OCH3)，14.1(C-2′)。以上数据与文献[15]基本一致，故鉴定为ethylp-methoxy-trans-cinnamate。

化合物10白色蜡状物;ESI-MS：m/z177 [M+H]+，分子式为C11H12O2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.67(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7)，7.59(2H，m，H-2，H-6)，7.40(3H，dd，J= 9.5，6.0 Hz，H-3，H-4，H-5)，6.51(1H，dd，J= 16.0，1.1 Hz，H-8)，4.23(2H，q，J= 7.1 Hz，H-10)，1.30(3H，m，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：168.7(C-9)，146.1(C-7)，135.7(C-1)，131.5(C-4)，130.0(C-3，C-5)，129.2(C-2，C-6)，119.0(C-8)，61.6(C-10)，14.7(C-11)。以上数据与文献[16]基本一致，故鉴定为肉桂酸乙酯。

化合物11白色针状晶体(氯仿);ESI-MS：m/z413 [M+H]+，分子式为C29H48O。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.34(1H，dd，J= 3.4，1.8 Hz，H-6)，5.15(1H，dd，J= 15.2，8.6 Hz，H-22)，5.02(1H，dd，J= 15.2，8.7 Hz，H-23)，3.52(1H，ddd，J= 15.2，10.9，4.5 Hz，H-3)，1.01(3H，q，J= 6.5 Hz，H-19)，0.90(3H，d，J= 6.5 Hz，H-21)，0.86～0.78(3H，overlapped，H-26，H-27，H-29)，0.68(3H，d，J= 9.2 Hz，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：140.8(C-5)，138.4(C-22)，129.4(C-23)，121.9(C-6)，71.9(C-3)，57.0(C-14)，56.1(C-17)，51.4(C-9)，50.2(C-24)，42.4(C-4，C-13)，40.6(C-20)，39.7(C-12)，37.4(C-1)，36.7(C-10)，32.0(C-7，C-2，C-25)，31.8(C-8)，29.0(C-16)，25.5(C-28)，24.5(C-15)，21.3(C-21)，21.1(C-11，C-27)，19.6(C-26)，19.1(C-29)，12.3(C-19)，12.1(C-18)。以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定为豆甾醇。

化合物12无色油状物;ESI-MS：m/z126 [M+H]+，分子式为C6H7NO2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.57(1H，s，H-2)，7.47(1H，dd，J= 8.2，1.8 Hz，H-6)，6.76-6.73(1H，m，H-5)，3.87(3H，s，CH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：150.2(C-4)，148.1(C-3)，124.2(C-6)，115.4(C-2)，114.0(C-5)，56.2(-OCH3)。以上数据与文献[18]基本一致，故鉴定为3-hydroxy-4-methoxypyridine。

化合物13浅黄色粉末;ESI-MS：m/z592 [M+NH4]+、597[M+Na]+，619[M+COOH]-，分子式为C35H58O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3∶CD3OD = 3∶1)δ：5.30(1H，s，H-6)，5.08(1H，dd，J= 15.1，8.6 Hz，H-22)，4.95(1H，dd，J= 15.2，8.8 Hz，H-23)，4.34(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1′)，3.51(1H，m，H-3)，1.19(3H，s，H-21)，0.94(3H，s，H-19)，0.77(3H，d，J= 6.1 Hz，H-26)，0.63(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3∶CD3OD = 3∶1)δ：140.2(C-5)，138.4(C-22)，129.2(C-23)，122.3(C-6)，101.1(C-1′)，79.2(C-3)，76.3(C-3′)，75.7(C-5′)，73.5(C-2′)，70.2(C-4′)，61.9(C-6′)，56.8(C-14)，56.1(C-17)，51.2(C-9)，50.2(C-24)，42.2(C-13)，40.5(C-12)，39.6(C-20)，38.7(C-4)，37.2(C-1)，36.8(C-10)，31.9(C-7)，31.9(C-8)，31.9(C-25)，29.7(C-2)，28.9(C-16)，25.4(C-28)，24.3(C-15)，21.2(C-11)，21.1(C-21)，19.3(C-27)，19.2(C-19)，18.9(C-26)，12.2(C-29)，12.0(C-18)。以上数据与文献[19]基本一致，故鉴定为豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.2 活性筛选

清除DPPH自由基[20]初筛实验结果表明(见表1)，化合物1～13均具有一定的抗氧化活性，其中化合物3和6的DPPH自由基清除率较高，表现出较好的抗氧化活性。对其进一步复筛，计算其IC50值，分别为105.18、299.89 μM。

3 讨论与结论

本研究对刺苞老鼠簕的化学成分进行分析，从刺苞老鼠簕全草甲醇提取物的乙酸乙酯部位中分离鉴定了13个化合物，其中包括5个生物碱(其中1、6为苯并噁唑啉酮类生物碱，2为吲哚类生物碱，7为β-卡波林类生物碱、12为吡啶类生物碱)、2个苯丙素类及2个甾醇类化合物。苯并噁唑啉酮类生物碱为老鼠簕属的主要和特征性成分，与文献报道的同属植物的化学成分相同[23]。在自然条件下，苯并噁唑嗪酮也可降解为苯并噁唑啉酮，是禾本科作物中重要的次生代谢产物，可通过抑制叶绿体的光合磷酸化抑制一些幼苗生长，其作为除草剂的研制开发具有广阔的应用前景[24]。咔唑生物碱为首次在老鼠簕属植物中分离得到。咔唑是芸香科植物的主要成分，不仅可插入DNA，还能抑制端粒酶和调节蛋白磷酸化，其在天然产物抗癌治疗中扮演着重要的角色[25]。化合物中儿茶酚(3)不仅显示了较好的清除DPPH自由基的能力，而且体外抗炎实验中也显示了较好的活性。Ramalingam等[26]研究中也表明儿茶酚衍生物具有较好的抗氧化活性，其治疗慢性肾炎的作用机制还需要进一步研究探讨。