卵巢癌中MSI2蛋白表达及与临床病理特征的关系

甄 娟，刘玉东，宋春红，吴 莎，焦瑞芬

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，是发达国家妇科癌症死亡的主要原因[1]。卵巢上皮性癌是最常见的病理类型，占所有类型卵巢癌的90%，由于卵巢位于盆腔内，早期症状隐匿，早期诊断缺乏敏感性和特异性均较高的指标，多数患者确诊时已为晚期，且卵巢癌极易发生远处转移，严重威胁着女性的健康和生命。卵巢癌患者标准治疗方法是行肿瘤减灭术后接受铂类化疗，尽管一线治疗方案已取得较大进展，多数患者仍会复发，并对铂类化疗产生耐药[2-3]。因此，提高卵巢癌早期检出率和寻找有效的基因进行靶向治疗是提高卵巢癌患者生存率的最重要手段。近来研究发现，MSI2是造血干细胞的重要调节因子，在白血病和多种实体肿瘤中异常表达，且与肿瘤低分化状态、淋巴结转移及患者不良预后密切相关[4-8]。由此可见MSI2作为肿瘤促进因子发挥生物学作用，并对临床评估患者的预后具有重要意义。然而MSI2在卵巢癌中的相关研究较少，本实验采用免疫组化和Western blot法检测MSI2在卵巢癌组织中的表达情况，分析MSI2表达与卵巢癌临床病理特征及患者预后的相关性，寻找卵巢癌新的诊断、靶向治疗和预后评估分子标志物。

1 材料与方法

1.1 材料收集2010年1月～2021年10月石家庄市第四医院/河北医科大学附属妇产医院存档的妇科手术切除标本164例，其中卵巢癌75例，癌旁正常卵巢组织50例，输卵管组织39例，所有患者术前均未接受药物治疗及放、化疗。标本石蜡包埋切片后经HE染色后明确诊断，诊断标准参照WHO(2020)卵巢肿瘤分类标准和FIGO分期系统。根据病理特征和分子遗传学改变确定肿瘤类型(其中Ⅰ型卵巢癌36例和Ⅱ型卵巢癌39例)。术中同时留取同一患者的卵巢癌组织及癌旁正常卵巢组织和输卵管组织，新鲜组织离体后取少量放入EP管立即冻存于液氮后，移入-80 ℃低温冰箱保存，以备Western blot检测。本实验通过了本院伦理委员会审核，且获得患者知情同意。

1.2 主要试剂兔抗人MSI2单克隆抗体(ab76148)购自Abcam公司，免疫组化SP试剂盒和DAB显色剂均购自福州迈新公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 标本均经10%中性福尔马林固定、脱水、透明、浸蜡、包埋，4 μm厚连续切片。操作过程严格按照免疫组化SP试剂盒说明书步骤进行MSI2(1 ∶400)染色。观察MSI2在卵巢癌组织、癌旁正常卵巢组织及输卵管组织中的表达部位。判读标准：阳性标准主要表现为细胞核/质/膜出现清晰的着色及达到一定数量阳性细胞。每张切片随机选取5个高倍视野(400×)，每个视野计数200个细胞。(1)按细胞着色深浅评分：无细胞着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。(2)按阳性细胞所占百分比评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，>80%为4分。将上述两项评分相乘作为最终结果：≥3分为阳性，<3分为阴性。

1.3.2Western blot法 将新鲜组织剪碎、裂解、再粉碎、匀浆、离心，提取上清液为总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，取80 μg蛋白样本进行聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳、转膜，脱脂奶粉封闭2 h，MSI2与内参β-actin一抗4 ℃孵育过夜，第2天洗膜后与相应二抗37 ℃孵育2 h，发光，扫描图像并分析各条带的光密度值，以目的蛋白与β-actin光密度值比值作为相对表达量。

1.3.3随访 对所有卵巢癌患者术后进行定期随访，主要采用患者门诊复查及电话随访等方式，平均每6个月随访1次，若随访期间出现患者死亡，规定其死亡时间为终止时间，亦纳入生存分析。

2 结果

2.1 卵巢癌组织、癌旁正常卵巢组织及输卵管组织中MSI2蛋白的表达免疫组化结果显示，卵巢及输卵管组织中MSI2的表达主要位于细胞质，部分位于细胞核(图1)，其在卵巢癌中的阳性率(73.33%，55/75)高于癌旁正常卵巢组织(16.00%，8/50)及输卵管组织(12.82%，5/39)，差异有统计学意义(χ2=39.448，P<0.001；χ2=37.686，P<0.001)。MSI2表达与Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期和淋巴结转移呈正相关(P均<0.05，表1)。

表1 卵巢癌组织中MSI2表达与临床病理特征的关系[n(%)]

图1 MSI2在不同组织中的表达，SP法；A.浆液性癌中MSI2呈弥漫强阳性；B.子宫内膜样癌中MSI2呈弥漫强阳性；C.黏液性癌中MSI2呈弥漫强阳性；D.透明细胞癌中MSI2呈弥漫强阳性；E.癌旁正常卵巢组织中MSI2呈阴性；F.输卵管组织中MSI2呈阴性

2.2 新鲜卵巢组织及输卵管组织中MSI2的表达量Western blot法检测结果显示，30例卵巢癌、30例癌旁正常卵巢组织和30例输卵管组织中MSI2的相对表达量分别为1.14±0.19、0.38±0.06、0.33±0.08。卵巢癌中MSI2的相对表达量高于癌旁正常卵巢组织及输卵管组织，差异有统计学意义(t=20.702，P<0.001；t=21.271，P<0.001)(图2)。

图2 MSI2在卵巢癌组织、癌旁正常卵巢组织及输卵管组织中的表达：MSI2在卵巢癌组织(C1、C2)中的表达高于输卵管组织(N1、N2)及癌旁正常卵巢组织(N3、N4)

2.3 MSI2表达与卵巢癌患者预后的关系生存分析结果显示，MSI2阳性患者中位生存时间为(45.00±4.364)个月；MSI2阴性患者中位生存时间为(60.00±2.137)个月。MSI2阳性患者生存时间及总生存率低于阴性患者(Log-rank检验Waldχ2=8.620，P=0.003，表2)。单因素和多因素分析结果表明，MSI2蛋白表达、肿瘤分型、FIGO分期、淋巴结转移与患者预后相关(P均<0.05，表2，图3)，MSI2蛋白表达水平是卵巢癌患者不良预后的可选预测因素之一(P=0.031，表3)。

表2 卵巢癌患者总生存率的单因素分析

表3 卵巢癌患者总生存率的多因素分析

图3 卵巢癌主要临床病理因素与患者预后的关系：A.MSI2表达；B.FIGO分期；C.淋巴结转移；D.肿瘤分型

3 讨论

MSI(musashi)蛋白家族是高度保守的RNA结合蛋白，在哺乳动物体内，MSI家族有MSI1和MSI2两个成员，MSI1和MSI2蛋白在N端有两个高度保守的RNA结合域(RNA banding domains, RBDS)，其序列同源性接近90%，在较不保守的C末端区，显示了约70%的序列同源性。MSI2基因定位于人染色体17q22，包含328个氨基酸，其编码蛋白MSI2具有2个剪接体形式(MSI2L和MSI2S)，相对分子质量分别为36.9×103和35.7×103，MSI2通过RNA识别结构序列(RNA recognition motif, RRM)直接识别并与RNA结合，进而抑制翻译过程，调控细胞生长、分化、增殖及造血干细胞、神经系统的发育。最初研究发现，MSI2过表达会促进白血病的发生、发展，随后越来越多的研究结果证实MSI2在大部分实体肿瘤中过表达并在肿瘤的增殖、侵袭过程中发挥关键作用[9-14]。

研究者利用BioExpress数据库和MethHC数据库，分析人类癌症TCGA的基因表达模式发现，与相应癌旁正常组织相比，许多人类癌症包括子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌和甲状腺癌等组织中MSI2 mRNA表达增高。随后在子宫颈癌中做了一系列表型实验，发现MSI2过表达促进子宫颈癌细胞集落形成，促进肿瘤细胞生长增殖和侵袭迁移，敲低MSI2的表达后，出现相反的结果[15]。Liu等[16]研究结果亦发现，与正常子宫颈组织相比，MSI2在子宫颈癌中的表达明显增高，且与FIGO分期和淋巴结转移密切相关，MSI2阳性患者总生存率和无进展生存率明显下降，Cox回归分析结果表明，MSI2是子宫颈癌总生存期和无瘤生存期的独立预测因素。Fang等[17]的研究结果表明，MSI2在肝癌细胞中高表达，过表达MSI2后，肿瘤细胞集落形成和存活率明显增加，肿瘤细胞凋亡下降，Ki-67表达增高，此外，敲低MSI2表达后，细胞对索拉非尼敏感性增加，表现为肿瘤细胞存活率和集落形成数量减少，凋亡升高，Ki-67表达下降。说明MSI2过表达或敲低改变了肿瘤相关基因的表达、自我更新以及肝癌细胞系对化疗的抵抗性，在小鼠异种移植模型中，过表达MSI2能显著增加肿瘤的体积和质量。同时MSI2过表达导致lin28a水平上调，MSI2和lin28a水平与肝癌患者的临床严重程度和预后呈正相关。Zhao等[18]研究发现MSI2在前列腺癌组织和细胞中高表达，并且与肿瘤分级呈相关性。MSI2在雄激素敏感和不敏感前列腺癌细胞中的下调均能抑制体内肿瘤的形成和体外细胞生长，敲低MSI2后肿瘤细胞集落形成减少，增殖能力下降，移植鼠肿瘤生成速率和生长速度均减慢，推测MSI2在肿瘤形成和生长过程中发挥重要作用，过表达的AR能够扭转MSI2敲除后的肿瘤抑制作用，MSI2与AR呈密切正相关。胶质母细胞瘤组织中MSI2高表达，MSI2基因沉默或过表达对肿瘤细胞的侵袭、迁移和增殖有明显影响。在异种移植模型中，MSI2表达沉默可明显抑制O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)的表达和肿瘤生长，并逆转替莫唑胺的耐药性[19]。在结肠癌、胆管癌和食管癌中的相关研究中发现，MSI2高表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移等恶性生物学行为有关。MSI2高表达患者的总生存率和无瘤生存期缩短，并且其是总生存率和无瘤生存期的独立预测因素[20-22]。由此可见，MSI2作为肿瘤促进因子在多种恶性肿瘤的发生及恶性生物学行为中发挥重要作用，且与患者不良预后相关。在卵巢癌中MSI2是否也发挥同样的促癌作用呢？本组Western blot实验检测结果示，MSI2在卵巢癌组织中的蛋白表达量高于癌旁正常卵巢组织及输卵管组织。与之一致的是，免疫组化结果亦显示，在卵巢癌组织中MSI2的阳性率高于癌旁正常卵巢组织及输卵管组织，统计分析结果显示，MSI2表达与Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期及淋巴结转移呈正相关，由此推测MSI2可能作为癌基因在卵巢癌的发生、发展及转移等过程中发挥重要的促进作用。本实验进一步结合患者的临床资料进行生存分析发现，高表达的MSI2、Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期及淋巴结转移的患者总生存率下降，生存期缩短，Cox多因素回归分析发现，MSI2的蛋白表达水平是卵巢癌患者不良预后的可选预测因素之一。

综上，本实验结果表明，MSI2作为促瘤因子在卵巢癌发生、发展、转移及预后评估过程中发挥重要作用。推测MSI2具有成为卵巢癌诊断标志物和治疗靶点的潜在可能，同时为临床评估患者的预后提供理论依据，然而本实验只是初步验证，其在卵巢癌中的具体机制有待积累大样本进行深入探究。