慢性牙周炎患者血浆和龈沟液蛋白羰基水平的研究

杨 洁，柳玉梅，吴文蕾，孙卫斌

慢性牙周炎是由牙菌斑长期积聚而引起的牙周支持组织慢性感染性疾病，主要临床表现有牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙齿松动移位等。

牙菌斑中含有多种病原微生物，细菌的刺激诱导宿主细胞产生促炎因子，招募巨噬细胞等炎症细胞到牙周炎症组织局部，通过产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)抵御微生物的侵袭。ROS产生过量时，会导致牙周炎症部位发生氧化应激，加剧牙周损伤[1-2]。ROS可诱导多种类型的蛋白质氧化修饰，其中蛋白质羰基化是一种不可逆的修饰类型，蛋白羰基(protein carbonyl，PC)水平是评价蛋白质总氧化水平的常用方法[3]。与其他蛋白质氧化损伤相比，羰基诱导产生相对较难[4]，也提示PC可能是一种更敏感的氧化应激指标。

本研究拟通过检测慢性牙周炎患者血浆和龈沟液中PC水平，以评价全身和牙周局部的蛋白质氧化及其与慢性牙周炎临床指标水平的相关性。

1 资料与方法

1.1 实验对象

选择2017年8月至2019年3月就诊于南京大学医学院附属口腔医院牙周病科的患者，经南京大学医学院附属口腔医院伦理委员会批准(编号2017NL-016(KS))，所有参与者签署知情同意书。慢性牙周炎患者诊断标准依据《牙周病学》第4版：①牙龈有炎症和探诊出血；②牙周组织破坏程度与局部刺激物的量较一致；③牙周袋>3 mm，有附着丧失；④X线片显示牙槽骨吸收；⑤排除侵袭性牙周炎及反映全身疾病的牙周炎。正常对照组为没有牙周病史且牙周检查健康，无牙位探诊深度(probing depth，PD)超过3 mm者。

纳入标准：①年龄不超过60岁；②根据诊断标准诊断为慢性牙周炎或牙周健康者；③6个月内未接受牙周治疗。

排除标准：①有吸烟史；②研究对象患糖尿病、冠心病等系统性疾病史，6个月内曾服用抗生素、抗炎药物、抗氧化剂维生素。

最终纳入46例研究对象，其中慢性牙周炎组24例，男10例，女14例，年龄(51.21±4.82)岁；正常对照组22例，男10例，女12例，年龄(49.86±5.35)岁。

1.2 主要试剂和仪器

蛋白羰基检测试剂盒(Cayman chemical，美国)、牙周探针(Hu-Friedy，美国)、酶标仪(Molecular devices，美国)、台式高速离心机(Heraeus，德国)、数显恒温水浴锅(金昌，中国金坛)、电热恒温干燥箱(精恒，中国上海)、紫外分光光度计UV-2450/2550(岛津，日本)

1.3 牙周检查

使用牙周探针检测研究对象全口牙齿唇(颊)侧近中、唇(颊)侧中部、唇(颊)侧远中、腭(舌)侧近中、腭(舌)侧中部、腭(舌)侧远中等6个位点，记录患者的菌斑指数(plaque index，PI)、牙龈指数(gingival index，GI)、PD、临床附着水平(clinical attachment level，CAL)。所有临床检查均由同一名检测者完成。

1.4 样本采集

1.4.1 血浆样本采集 收集样品前评估研究对象的依从性，抽取受试者静脉血于枸橼酸钠抗凝管中，4 ℃放置30 min后室温3 000 r/min转速离心10 min。收集血浆并分装到1.5 mL EP管中，封膜，编号，置于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.4.2 龈沟液样本采集 患者漱口，取样部位用棉卷隔湿，用无菌刮匙刮除龈上菌斑，由颈部向冠方用压缩空气吹干牙面。将2 mm×8 mm滤纸条置入龈沟静置30 s，取出后装入1.5 mL无菌EP管中，封膜，编号，置于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.5 PC含量的测定

根据PC检测试剂盒说明书操作。将2，4-二硝基苯肼(DNPH)溶于2 mol/L盐酸溶液至终浓度为10 mmol/L，取0.1 mL血浆或者龈沟液加入0.5 mL该溶液中处理，等体积2 mol/L盐酸溶液处理作为对照。反应混合物室温避光放置1 h，每隔15 min搅拌一次。随后加入0.5 mL冰20%三氯乙酸，冰上放置15 min，11 000 r/min离心5 min沉淀蛋白。将乙醇与乙酸乙酯以1∶1体积比混合，配制成乙醇-乙酸乙酯溶液。沉淀蛋白用1 mL乙醇-乙酸乙酯溶液洗涤3次，以去除未反应的DNPH和残余脂质。每次洗涤后3 000 r/min离心7 min，最终获得的沉淀用0.25 mL 6 mol/L盐酸胍溶解，37℃孵育10 min。通过分光光度计测定360 nm处吸光度值，测定PC浓度。Bradford法[5]测定血浆及龈沟液的总蛋白浓度。PC含量通过PC浓度/总蛋白浓度计算，单位用nmol/mg蛋白表示。

1.6 统计分析

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。所有数据均用Shapiro-Wilk test评估数据分布的正态性，正态分布的计量数据以均数±标准差表示，用独立样本t检验分析组间是否存在差异。非正态分布的数据以中位数(范围)表示，采用非参数检验Mann-Whitney检验分析组间是否存在差异。Pearson相关性分析临床检测参数和PC之间的关系。P<0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床检查

对患者进行牙周检查，结果如表1所示。正常对照组PI、GI、PD、CAL均明显低于慢性牙周炎组，且均有统计学差异(P<0.05)。

表1 研究对象牙周临床参数Tab.1 Comparison of clinical periodontal parameters among groups

2.2 血浆和龈沟液PC含量

检测患者血浆和龈沟液中PC浓度，结果显示慢性牙周炎组血浆中PC浓度为(2.20±0.40)nmol/mg，正常对照组PC水平为(1.59±0.35)nmol/mg，慢性牙周炎组血浆PC水平明显高于正常对照组(P<0.001)。慢性牙周炎组龈沟液中PC浓度为(1.95±0.53)nmol/mg，正常对照组为(1.11±0.29)nmol/mg，与正常对照组对比，慢性牙周炎组龈沟液中PC浓度明显增高(P<0.001)(图1)。

***：与正常对照组相比，P<0.001

2.3 PC含量与牙周临床参数的关系

Pearson相关性分析临床检测参数和PC浓度之间的关系，结果如图2～3所示，血浆PC水平与PI、GI、PD、CAL的相关系数分别是0.521、0.501、0.575、0.551，具有统计学意义(P<0.001)。龈沟液PC浓度与牙周参数PI、GI、PD、CAL的相关系数分别是0.612、0.651、0.612、0.730，具有统计学意义(P<0.001)。由此可见，牙周临床参数PI、GI、PD和CAL与血浆和龈沟液PC浓度之间均呈明显正相关。

图2 血浆PC浓度与PI、GI、PD、CAL的相关性Fig.2 Correlations between plasma PC levels andPI, GI, PD, CAL

3 讨 论

慢性牙周炎是一种常见的由细菌感染引起的口腔慢性炎症性疾病， 了解牙周病的炎症状态及进展情况，有利于及时治疗和预防。

图3 龈沟液PC浓度与PI、GI、PD、CAL相关性Fig.3 Correlations between gingival crevicular fluid PC levels and PI, GI, PD, CAL

牙周炎是牙周致病菌与宿主免疫反应相互作用的结果，氧化应激是病理机制之一。正常情况下，机体氧化应激维持在一个稳定的低水平范围，参与信号通路的调节，在细胞生长和分化、抵抗病原微生物侵袭等方面发挥作用。当大量牙周致病菌存在时，细菌感染激活宿主免疫反应，可诱导明显的氧化损伤[6-7]。研究发现，牙周炎过程中氧化应激呈上升趋势，外周血活化的吞噬细胞内ROS产物明显增加，唾液、龈沟液及牙龈中脂质过氧化物含量也明显增高，细胞抗氧化能力减弱，导致线粒体DNA过早氧化损伤[8]。蛋白质羰基化是一种不可逆的氧化损伤类型，ROS攻击氨基酸残基侧链中自由氨基或亚氨基，生成醛基，同时释放NH3，生产羰基[9-10]。蛋白质羰基化是细胞氧化损伤的重要标志，会影响蛋白质的功能。研究发现，阿尔茨海默病、帕金森病、风湿性关节炎、糖尿病及动脉粥样硬化等多种疾病与蛋白质羰基化相关[11-15]。

多项研究发现，牙周健康状况与唾液及龈沟液中增高的蛋白羰基化浓度有关。Wei等[19]的研究显示，慢性牙周炎患者唾液中PC含量比牙周健康者高。Sculley等[20]通过调查129例患者社区牙周治疗需求指数(community periodontal index of treatment needs，CPITN)评估患者牙周健康状况与唾液PC的关系，发现CPITN评分低的患者较评分高的患者PC值明显升高。Pradeep等[21]通过比较慢性牙周炎、牙龈炎和正常人龈沟液PC值，发现慢性牙周炎患者龈沟液PC含量增高，且PC值与牙周PD和CAL正相关。由此可见，牙周健康状况差的患者易于受到更严重的氧化损伤。本研究发现，受试者临床参数PI、GI、PD和CAL与蛋白羰基化水平呈正相关。PI、GI、PD和CAL分别从口腔卫生、牙龈炎症和牙周组织破坏三方面评估牙周状况，蛋白羰基化的增多与牙周炎的严重程度密切相关。本研究中龈沟液与牙周指数的关系强于血浆，这可能是由于牙周致病菌优先在牙周组织引起病理变化，局部牙周炎可影响全身蛋白氧化，因此全身氧化损伤的变化滞后于局部出现。

蛋白羰基化水平增高不仅是氧化应激的标志，也是疾病导致的蛋白功能紊乱的标志。然而，目前尚无证据表明PC是牙周炎的原因或是结果。Chapple等[25]观察到龈沟液抗氧化能力在牙周治疗后有所增加，推测氧化产物可能导致了牙周炎的进展。因此，更有可能是蛋白羰基化产物导致了疾病的进展，而非在牙周炎病原学中起作用。结合本研究，蛋白质的羰基化可能为慢性牙周炎的氧化损伤提供新的诊断标记物，作为提示牙周炎进展及严重程度的指标。

4 结 论

慢性牙周炎患者血浆和龈沟液蛋白羰基化水平升高，PC与牙周临床参数具有密切联系，PC值可能作为评价牙周炎症状态的一项指标。