3D打印钴铬合金和铸造钴铬合金的理化性能和生物相容性的比较

刘 爽，马国武

钴铬合金因其良好的生物相容性、耐磨性和耐腐蚀性，且价格低廉,已成为口腔科学应用最广泛的金属材料。目前，钴铬合金材料可以采用传统的铸造工艺和3D打印技术加工制备而用于口腔修复科，传统铸造技术受周期、铸件性能的影响，存在不同的缺陷[1]，3D打印则常采用选择性激光熔融技术(selective laser melting，SLM)，具备精确的数字化模型，具有制作过程无模具，人为干预少的优点而受到关注[2]。研究表明3D打印在组织相容性方面具有优势[3]，应用SLM技术制成的金属样品与细胞生物性能的研究比较中[4-5]，样品在细胞生长、迁移和粘附方面表现出很好的生物相容性。而关于3D打印钴铬合金与铸造合金在理化性能和生物学影响的全面比较的研究较少[6]。

本研究以常见的钴铬合金为原料，利用3D打印的选择性熔融技术、传统的铸造技术制作钴铬合金试件，通过硬度测定、耐腐蚀性检测、细胞毒性及凋亡实验检测，为3D打印钴铬合金在临床应用上进一步提供科学的数据和依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验设备及材料

钴铬合金金属粉和金属块(Co 63.54%、Cr 24.88%、W 5.05%、Si 0.78%)，金属3D打印机(铂力特BLT-A100，西安)，义获嘉烤铸一体炉(EP 3010，义获嘉伟瓦登特上海商贸有限公司)，洛氏硬度计HR-150A、金相显微镜(均由大连理工大学材料学院提供)，超声波清洗器(济南永兴伟业仪器仪表有限公司)，电化学工作站(辽宁石油化工大学提供)，小鼠成纤维细胞(武汉博士德生物工程有限公司)，CCK-8增殖细胞毒检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(均购自南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.2 试件制备

以金属粉末和金属块为原材料采用金属3D打印机(激光功率7.4 kW，扫描速度7 m/s，送粉速度2 ～10 cm3/h，光斑直径70～200 μm，保护气体为氮气，保护气体流量为1 m3/h，层厚0.03 mm)和义获嘉烤铸一体炉分别制作出直径25 mm高1 mm的圆柱试件各10个。

1.3 理化实验方法

1.3.1 洛氏硬度测定 测量金属试件表面洛氏硬度载荷60 kg，取5点计算平均值。

1.3.2 金相观察 将各金属试件依次用400、600、800、1 000、2 000目砂纸进行打磨处理，并抛光至镜面，用现制王水(V(HNO3)∶V(HCl)=1∶3)腐蚀60 s，在金相显微镜下观察并分析样品金相组织。

1.3.3 极化曲线的测定 本实验采用三体电极体系，金属试样为工作电极，石墨为辅助电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，动电位极化曲线由美国PAR公司的2273电化学工作站测试完成。以1 mV/s的速率进行计划扫描，扫描电位范围为-0.8～0.6 V。将金属试件放入模拟体液中，在自腐蚀电位下对金属试件进行电化学阻抗测试，测量频率范围为100 kHz～10 MHz，扰乱电位为10 mV，测量在自腐蚀电位下进行，测量结果用Origin软件进行数据拟合。

1.4 生物学实验方法

1.4.1 浸提液的制备 根据中华人民共和国国家标准GB/T 16886.12-2005/ISO 10993-12：2002，在无菌操作台中，将已经制备好的试件按3 cm2/mL比例浸泡于新鲜的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、5% CO2条件下连续浸提72 h。然后按体积分数加入10%的胎牛血清和1%双抗，混匀，4 ℃保存备用。

1.4.2 实验分组 阴性对照组(a)、实验组3D打印钴铬合金浸提液(b)、铸造钴铬合金浸提液(c)，空白对照组(d)，每组5个平行。

1.4.3 细胞毒性检测 将处于对数生长期的L-929细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养液稀释成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，接种至96孔板中，每孔细胞悬液100 μL，置于37 ℃、饱和湿度、CO2浓度为5%的细胞培养箱内培养12 h，待细胞贴壁后，弃原培养基，PBS冲洗，分别加入a、b、c、d组浸提液或培养基，至培养箱中继续培养24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，微振荡后置入培养箱，3 h后终止培养，用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定各孔吸光度，重复5次取各组平均值。计算小鼠成纤维细胞L-929的相对增殖率，根据细胞毒性评定标准对各组结果进行评价。

1.4.4 运用AnnexinⅤ-FITC/PI荧光染色检测细胞凋亡 待L-929细胞在a、b、c、d各组浸提液中培养48 h后，吸出各孔中的钴铬合金浸提液，用不含EDTA的0.25%胰酶对细胞进行消化3 min，将消化下来的细胞悬液与各孔吸出的钴铬合金浸提液一起离心，1 000 r/min 5 min，PBS洗涤2次，加入500 μL的Binding Buffer 悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀，室温、避光、反应5～15 min，在1 h内用流式细胞仪检测，流式细胞仪激光波长用488 nm，用一波长为515 nm通道滤器检测FITC，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。重复3次取平均值，观察各组细胞流式细胞仪散点图，计算每组细胞凋亡率。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 洛氏硬度测量

3D打印组、铸造组的洛氏硬度分别为70.6±0.1、68.5±0.2，3D打印组强于铸造组，两组比较差异有统计学意义(P<0.005)。

2.2 金相观察

由图1可看出3D打印钴铬合金组织没有第二相；铸造组织为树枝晶，第二相强化。

A：3D打印组；B：铸造组

2.3 极化曲线分析

由图2可知各种金属试件在模拟体液中的腐蚀参数，即自腐蚀电位、自腐蚀电流密度，数值见表1(阴极极化曲线和阳极极化曲线直线部分外延，相交于一点，纵坐标为自腐蚀电流密度，横坐标为自腐蚀电位，该点处电流为维钝电流[7])。由于耐腐蚀性与自腐蚀电流密度和维钝电流成负相关[8]，由图2可看出在耐腐蚀性方面3D打印钴铬合金强于铸造钴铬合金。

表1 各种金属试件在生理盐水中的腐蚀参数Tab.1 Electrochemical parameters of various metal specimens in normal saline

图2 各组金属试件在生理盐水中的极化曲线Fig.2 Polarization curves of each group of metal specimens in normal saline

2.4 CCK-8检测细胞毒性

24、48、72 h时，3D打印组、铸造组、阴性对照组之间细胞毒性差异有显著性意义，铸造组细胞毒性最强，且各组均随着时间延长细胞毒性逐渐增强(图3)。参考美国药典，细胞毒性评价结果为表2。

*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001

表2 各组细胞相对增殖率和细胞毒性等级Tab.2 Relative cell proliferation rate and cytotoxicity level of each group

2.5 细胞凋亡实验

经流式细胞仪显示各象限的正常细胞和不同时期的凋亡细胞(图4)，并分析计算凋亡率，3D打印组、铸造组、阴性对照组细胞均以正常细胞为主，三组的凋亡率分别为(3.513±0.055)%、(5.407±0.401)%、(2.497±0.121)%，各组间均有统计学意义(P<0.01)。

A：阴性对照组；B:3D打印组；C:铸造组

3 讨 论

传统的铸造技术生产的钴铬合金作为口腔科材料在临床应用已有几十年之久，在其制造的繁琐工艺中，很容易出现错误。3D打印则是一种快速成型技术[9]，用SLM技术生产钴铬合金时，可以在相对短的时间段内，直接借助电脑辅助的设计模型，以钴铬粉末为原料，一层一层地从模型的切片数据中用激光融熔的数据“打印”产品，新一层的金属粉末覆盖在熔化层之上，激光则根据切片中的数据再次扫描熔化这些金属粉末，不断循环直到自动化地完成产品为止，具有节省人力物力的优点[10]，然而其制造的钴铬合金产品在临床应用上的特性则有待验证。

本实验选用了3D打印钴铬合金和铸造钴铬合金，测定硬度、极化曲线，进行金相观察，并制备浸提液检测其对小鼠成纤维细胞L-929的生物相容性。

口腔具有复杂的咀嚼环境，金属材料的表面硬度是其抵抗外力防止变形的重要性质，具有良好硬度的材料可以增加其在口腔修复治疗后的使用年限。一般常温下，组织越细，表面硬度越高，由图1可以看出铸造组织为树枝晶，第二相强化，3D打印组织为快速凝固，固溶强化，所以硬度较铸造组织高。同时铸造组织的第二相与基体自腐蚀电位不同，形成原电池，3D打印技术表现出更耐腐蚀的特点，这与之前的研究[11]一致。3D工艺产生的钴铬合金表现得更致密更光滑，这与其表面硬度和耐腐蚀性有一定的关系[12]。

口腔金属材料腐蚀可释放金属离子和腐蚀衍生物，作用于细胞，产生细胞毒性[13]。Richardson等[14]研究口腔材料的细胞毒性时发现，浸提液中离子浓度越大，则细胞毒性越强，离子的浓度与口腔黏膜细胞的损伤成正相关[15]。金属离子作为一种化学因素作用于细胞，可导致DNA损伤，若损伤不能修复，则启动细胞进入程序性凋亡，且析出的金属离子浓度不同，细胞效应也不同，对邻近的器官及远隔器官的损伤也不同[16]。在本实验的条件下，从细胞毒性和细胞凋亡两方面检测，3D打印加工工艺的钴铬合金均优于铸造钴铬合金，这可能是由于3D打印钴铬合金的耐蚀性较好，培养基中析出的金属离子和腐蚀衍生物较少的原因。

综上所述，3D打印钴铬合金试件在机械性能耐腐蚀性和细胞毒性上的表现均优于传统铸造钴铬合金，本实验进一步证明了3D打印钴铬合金在口腔领域的临床应用价值。目前，3D打印技术由于快速成型，更精准化的特点，是一种由大批量制造模式向个性化制造模式转变的技术[17-18]，已应用于神经外科[19]、颌面部赝复体的制作[20]等领域。由于3D打印与人体组织的相互关系，未来分子生物学与材料学和医学的多学科联动可能会为3D打印的发展提供新的机会[21]。