电针结合鳖甲煎丸对H22肝癌小鼠肿瘤抑制作用及机制研究

黄争春 常欣峰

摘 要：目的：观察电针足三里、三阴交结合鳖甲煎丸对H22肝癌小鼠肿瘤抑制作用并探讨其作用机制。方法：建立H22肝癌小鼠模型，将100只小鼠随机分为正常组、模型组、环磷酰胺组、电针组、鳖甲煎丸组、针药联合组，给予相应刺激14 d后，取肿瘤组织称重，计算抑瘤率;采用Western blot方法检测肿瘤组织VEGF、Delta-4、NICD蛋白表达情况。结果：针药联合能够抑制H22小鼠肿瘤生长;Western blot结果显示针药联合能明显降低VEGF、Delta-4和NICD蛋白表达。结论：针药联合可通过阻断VEGF/Dll4-Notch信号通路，抑制肿瘤血管生成，从而发挥抑瘤作用。

关键词：针药联合;H22肝癌小鼠;VEGF/Dll4-Notch信号通路

原发性肝癌在我国发病率高、存活率低，目前缺少切实有效的治疗方法，是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤。中医药以其整体调整的优势对该病的治疗具有不可忽视的重要意义。课题组前期研究证实鳖甲煎丸具有活血、补益、散结之功，可以较好的抑制肝癌生长，防止肿瘤细胞转移。而足三里穴为足阳明胃经合穴，针刺足三里穴能纠正神经-内分泌-免疫系统失调，对预防运动性疲劳和提高机体免疫力有非常显著的疗效[1，2]。三阴交穴始载于《内经》，为三焦之气所生处，是补益元气、调和气血，补虚强壮之要穴，现代医学证明，电针刺激三阴交可提高细胞免疫和体液免疫功能[3，4]。基于对原发性肝癌病因病机的认识，我们将电针足三里、三阴交与口服鳖甲煎丸结合起来，对H22肝癌小鼠进行干预治疗，观察疗效并探讨其作用机制。

一、材料

1.动物及细胞株

清洁级雄性昆明小鼠100只，6～8周龄，质量18～22g，由赣南医学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK（赣）2018-0004。H22细胞株，由中国医学科学院医药研究所购进，液氮中保存。

2.药品和试剂

环磷酰胺，白色粉状针剂，0.2g/支，江蘇恒瑞医药股份有限公司生产;VEGF抗体（Santa Cruz，sc-152）、Delta-4抗体（Santa Cruz，sc-18640）;NICD抗体（Cell Signaling，#4147）;BCA蛋白定量试剂盒购自天根生化科技有限公司（货号：A：Lot#J9122;B：Lot#J8830）。

3.仪器

ME104型电子天平（进口），多功能酶标仪（美国Thermo公司），垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司），AI600UV型化学发光成像系统（美国GE公司）。

二、方法

1.鳖甲煎丸加减方制备

本方由鳖甲、大黄、黄芩、丹参、柴胡等药物组成。以常规方法煎煮、过滤、沉淀后，参照《药理实验方法学》（徐叔云主编），按照小鼠日摄取量为同重量人体用药量8倍计算，浓缩制成含生药1.24g/mL的溶液，4℃冰箱保存备用。

2.H22肝癌小鼠模型的建立

无菌条件下抽取接种H22瘤株 7天的小鼠腹水，生理盐水稀释、离心、重悬，肿瘤活细胞比率>95%，调整细胞浓度为1×107个/mL。75%酒精消毒小鼠右侧腋窝，0.2 mL/只接种于小鼠右腋部皮下。

3.分组及治疗

接种后次日，将100只小鼠随机分为5组，即模型组、阳性药组（环磷酰胺）、电针组、中药组、针药联合组，每组20只。阳性药物组于小鼠腹腔注射环磷酰胺;电针组给予2/100Hz交替频率刺激双侧三阴交、足三里穴，每次30分钟（小鼠穴位定位参照李忠仁《实验针灸学》）;中药组给予鳖甲煎丸水煎剂灌胃，0.2mL/10g;针药联合组给予电针和鳖甲煎丸共同治疗;模型组以等体积生理盐水灌胃。以上处理自造模第二日起，每日1次，连续治疗14日，于第15日，称重后，处死小鼠，取材检测。

4.瘤重及抑瘤率测定

治疗期间观察小鼠一般状态，并比较各组小鼠肿块大小。于末次给药24 h后，称体重，取瘤块称重，计算抑瘤率;

5.Western blot方法检测

肿瘤组织中VEGF/Dll4-Notch信号通路相应蛋白表达取肿瘤组织25mg，剪碎于1.5 mL EP管中，加入蛋白裂解液研磨，离心5 min，抽取上清液，即为组织总蛋白，用BCA蛋白检测法进行蛋白定量。取50 μg蛋白，调整体积为24 μl，电泳转膜后，脱脂牛奶封闭，一抗4℃孵育过夜;二抗室温孵育l h，化学发光成像系统照相，体积法测定各条带的光密度值。同样方法测定内参的光密度值。各组取4只小鼠的样本，重复试验3次，每次以模型组条带相对光密度值为1进行数据标准化，所得数据进行统计学分析。

6.统计学处理

采用SPSS 14.0统计软件进行数据处理，计量资料数据以±s表示，组间测定指标比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

三、结果

1.针药联合对H22肝癌小鼠肿瘤生长的抑制作用

治疗期间各组小鼠一般状况良好，无腹泻、活动迟缓等不良反应。针药组与模型组比较，小鼠瘤重明显降低（P<0.01）;与阳性药物组比较，小鼠瘤重无明显差异（P>0.05）。电针组、中药组及针药联合组抑瘤率分别为：28.6%、30.3%、42.5%，提示电针和鳖甲煎丸均可抑制肿瘤生长，针药联合效果更好（见表1）。

针药联合组小鼠肿瘤组织中VEGF、Delta-4和NICD蛋白表达与模型组比较均显著降低，有统计学意义（p<0.01）。提示针药联合可通过降低VEGF、Delta-4和NICD蛋白表达，阻断VEGF/Dll4-Notch信号通路，抑制肿瘤新生血管的形成，进而抑制肿瘤生长。（见表2）

四、討论

肿瘤血管在生长过程中受到体内多种因子的调控，其中VEGF是目前所知作用最强的促血管生长因子，对血管生成起到重要的调节作用，在几乎所有的实体瘤中，都伴有VEGF的上调。Dll4是惟一特异存在于内皮细胞的Notch配体，Dll4-Notch信号通路具有调控肿瘤血管发生的功能。Hainaud等[5]研究发现，Notch4/Dll4在肝癌的肝窦内皮细胞中高表达，并发现肝癌组织中Ephrin B2水平随肿瘤发展而上升，表明Dll4-Notch信号通路能促使肿瘤中血管静脉向动脉分化。Jakobsson等[6]在发育的血管和尖端细胞中，都发现有Dll4的高表达。VEGF与Dll4-Notch信号通路成正反馈关系，即在肿瘤血管的生成发育上，VEGF可以激活Dll4-Notch信号通路[7]。阻断荷瘤小鼠模型中VEGF，会促使Dll4表达下降，而使用VEGF刺激血管内皮细胞，则可使Dll4表达上调。

鳖甲煎丸来源于《金匮要略》，目前该方被广泛应用于临床，在治疗肝炎、肝硬化、肿瘤等疾病，均取得了良好的疗效。电针我们选取的是足三里、三阴交二穴。前期研究工作表明，电针刺激足三里、三阴交可以增强机体免疫力而抑制肿瘤生长。鳖甲煎丸亦具有寒热并用、攻补兼施、行气化瘀、软坚散结之功效，因此我们设想将针药联合起来治疗肝癌，观察疗效并探讨其作用机制。结果表明：针药联合可通过阻断VEGF/Dll4-Notch信号通路从而抑制H22肝癌小鼠肿瘤生长。

综上所述，针药联合可抑制H22肝癌小鼠肿瘤生长并诱导肿瘤细胞凋亡。其作用机制可能与阻断VEGF/Dll4-Notch信号通路，抑制肿瘤血管生成有关。本研究结果为临床进一步发挥中医整体特色治疗肝癌提供了实验依据。

参考文献：

[1] 不同深度针刺足三里穴对健康大鼠外周血细胞形态数量及淋巴细胞增殖能力和胸腺指数的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（29）：5687-5690.

[2] 针刺“足三里”穴对脾虚证模型大鼠肠系膜淋巴结T淋巴细胞亚群的影响[J].中国组织工程研究， 2018，22（4）576-581.

[3] 温针灸对胃癌手术后化疗患者NK细胞数量及其生物学活性的影响[J].国际免疫学杂志， 2021，44（1）： 1-6.

[4] 不同穴组电针预处理减轻肝脏缺血再灌注损伤的效应研究[J].湖南师范大学学报（医学版），2020，17（6）：7-10.

[5] Hainaud P， Contreres JO， Villemain A， et al. The role of the vascular endothelial growth factor Delta-like 4 ligand/Notch4-Ephrin B2 cascade in tumor vessel remodeling and endothelial cell functions[J]. Cancer Res， 2006， 66（17）： 8501-8510.

[6] Jakobsson L， Franco CA， Bentley K， et al. Endothelial cells dynamically compete for the tip cell position during angiogenic sprouting[J]. Nat Cell Biol，2010， 12（10）： 943-953.

[7] Caolo V， van den Akker NM， Verbruggen S， et al. Feed-forward signaling by membrane bound ligand receptor circuit： The case of NOTCH-Delta like 4 in endothelial cells[J]. J Biol Chem， 2010，285（52）：40681-40689.