基于JAK2/STAT3信号通路探讨参茸地黄汤调控自噬改善糖尿病的作用机制＊

金美英，潘韦韦，崔镇海＊＊

（1.长春中医药大学附属第三临床医院 长春 130117；2.长春医学高等专科学校健康学院 长春 130031）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一组以高血糖为特征由胰岛素抵抗和胰岛β细胞缺陷共同形成的代谢紊乱综合征[1]。其发病隐匿，病程长，容易被人忽视，致使糖尿病患者较正常人发生严重危及生命事件的风险大大增加，且给患者及社会带来较重的医疗负担[2]，因此防治糖尿病已经成为刻不容缓的重大问题。

中医学将T2DM称之为消渴病，又名“脾瘅”、“消中”、“消瘅”，《金匮要略》首以“消渴”为篇名，以肾虚辨治消渴，认为肾虚是消渴病发生发展的关键，先天禀赋不足，肾精亏虚，肾阴阳虚衰，封藏失司，上不能蒸腾津液于肺，下不能气化达于膀胱，开阖失司，气不化津，故见消渴诸症，肾精亏损日久，精血难生，脉道不充，加之气血津液不行，脉道瘀阻，结而成瘀，因此本研究以“肾虚血瘀”理论为基础，拟参茸地黄汤，本方由鹿茸、熟地、丹参、山药、山萸肉、黄连、茯苓、牡丹皮、骨碎补组成，以补肾活血，添精益肾。

JAK2/STAT3信号通路是参与机体分化、代谢、血管再生与侵袭的重要信号通路[3]，对氧化应激及细胞自噬、增殖、凋亡等发挥重要作用[4]。内源性酪氨酸激酶2（ja-nus kinase signal transducers 2，JAK2）是一种信号转导因子，信号传导和转录激活因子3（signal transduc-ers and activators of transcription 3，STAT3）为其受体，JAK2/STAT3信号通路的启动需要IL-6、TNF-α等炎症因子的参与，其中IL-6等TH2族细胞因子抑制自噬，TNF-α等TH1族细胞因子能够诱导自噬[5]。同时，该通路的活化又可促进大量炎症因子的释放，形成瀑布式炎症级联反应[6]。当炎症基因表达的水平过高时，通过激活自噬可抑制炎症因子水平[7]，减少组织损伤。自噬是存在于真核细胞中的一种程序化降解机制。自噬失衡参与了T2DM的发生发展[8-11]。Liang等[12]首次证实Beclin-1是一种自噬标志性蛋白质，Beclin-1属于酵母Atg6基因的同源物，为第一个在哺乳动物细胞中被发现的自噬基因[13]，当Beclin-1蛋白质的BH3结构与凋亡抑制蛋白质B细胞淋巴瘤类蛋白质的结合可抑制自噬的发生，而当凋亡抑制蛋白B淋巴瘤类蛋白质从Beclin-1上脱落时，自噬可被诱导[14]。微管相关蛋白 1A/1B-轻链 3（Microtubuleassociated protein 1A/1B-light chain 3，LC3）属于自噬体膜上标志性蛋白，其修饰对自噬体的形成至关重要[15-16]，LC3的存在是胞浆到空泡靶向囊泡的必要条件[17]，其表达情况在一定程度上可以反应自噬体的数量，这与证实自噬存在具有密切相关性[18]。研究表明：细胞自噬是细胞器功能和胰岛素信号的重要调节因子[19]，抑制自噬能减缓因内质网应激而导致的胰岛素受体水平减少[20]。葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）是胰岛素敏感组织的主要葡萄糖转运蛋白，主要介导胰岛素作用下的葡萄糖转运，在肝脏组织葡萄糖利用中发挥限速作用[21]，GLUT4在2型糖尿病小鼠的肝脏中表达降低，是肝脏胰岛素抵抗的重要原因之一[22]，自噬可通过胰岛素信号通路达到对GLUT4蛋白的转位（从细胞质转位于细胞膜）和GLUT4储存囊泡释放的影响[23]。基于此，本研究基于JAK2/STAT3信号通路，探讨参茸地黄汤影响自噬治疗2型糖尿病的可能作用机制，为中医药防治2型糖尿病寻找新的靶点。

1 材料与仪器

1.1 动物

8周龄SPF级SD雄性大鼠，实验动物购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK（吉）2018-0007。体质量180-220 g，共80只，饲养于长春中医药大学实验动物中心无特殊病原体动物（SPF）级屏障实验室（许可证号：SYXK（吉）2018-0013）。

1.2 实验饲料

SD大鼠普通维持饲料购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK（吉）2015-0005，成分：18%粗蛋白+4%粗脂肪+5%粗纤维+8粗灰分+1%钙+0.6%磷+10%水分+0.82%赖氨酸+0.53%（蛋氨酸+胱氨酸）；高脂饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0003，成分：67%维持饲料+10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+0.5%胆酸钠。

1.3 药物及试剂

参茸地黄汤由长春中医药大学附属医院制剂室提供，保存于4℃冰箱，参茸地黄汤药物组成：鹿茸10 g、熟地20 g、丹参20 g、山药20 g、山萸肉15 g、黄连15 g、茯苓15 g、牡丹皮15 g、骨碎补20 g。按比例混合中药，水煎滤渣取汁，制成中药溶液。盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023371）。链脲佐菌素（美国Sigma公司，货号WXBC2044V）；JAK2抗体（Proteintech，货号17670-1-AP）；STAT3抗体（Proteintech，货号60199-1-1g）；LC3抗体（Proteintech，货号 14600-1-AP）；Beclin-1抗体（Proteintech，货号11306-1-AP）；GLUT2抗体（Proteintech，货号20436-1-AP ）；β-actin抗体（Proteintech，货号600008-1-lg）；WB羊抗兔IgG HRP标记（Proteintech，货号SA00001-2）。

1.4 仪器

全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技，型号Chemray 800）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司；型号JB-P5）；-80℃冰箱（深圳市科力易翔仪器设备有限公司，型号DW-86L490J）；高速冷冻离心机（DRAGONLAB，型号D3024R）；电泳仪（BIOTED；型号1704486）；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司；型号Tanon-1600R）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司；SQP）。

2 方法

2.1 动物模型的建立

SD大鼠适应性喂养3天后，10只SD大鼠予普通维持饲料，其余70只SD大鼠予高脂饲料，所有SD大鼠均自由进食水，高脂饲料喂养4周后，予进食高脂饲料的70只SD大鼠禁食不禁水12 h，予链脲佐菌素（STZ）40 mg·kg-1单次腹腔注射，72 h后用罗氏血糖仪（ACCU-CHEK）及试纸测大鼠空腹尾静脉血糖≥16.7 mmol·L-1[12]，即为造模成功。

2.2 分组及给药

10只SD大鼠为对照组，造模成功的2型糖尿病SD大鼠随机分为4组，即模型组（12只）、参茸地黄汤低剂量组（12只）、高剂量组（12只），盐酸二甲双胍组（12只）。空白对照组SD大鼠予维持饲料，模型组、参茸地黄汤低、高剂量组、盐酸二甲双胍组大鼠继续予高脂饲料喂养，各组大鼠均自由进食水。分组后，模型组与对照组大鼠以等体积蒸馏水灌胃，参茸地黄汤低剂量组灌胃剂量为1.5 g·kg-1·d-1，高剂量组灌胃剂量为4.5 g·kg-1·d-1，盐酸二甲双胍组以盐酸二甲双胍片研磨成粉末，溶于蒸馏水配置盐酸二甲双胍药物溶液,给药剂量为 0.15 g·kg-1·d-1，各组每日固定时间灌胃，每日1次，均灌胃4周。

2.3 样本制备

各组大鼠灌胃4周后，禁食不禁水12 h，大鼠用10%水合氯醛（0.35 mL·100 g-1）腹腔注射麻醉，经大鼠腹主动脉取血，于10 mL离心管中静置2 h，3500 r·min-1低温高速离心15分min，取上层血清，放入2.5 mL离心管,置于-80℃冰箱保存待后续检测。处死SD大鼠后，冰上取材，暴露SD大鼠腹腔及肝脏组织，迅速用镊子及剪刀分离并取出肝脏组织，取出离体的肝脏组织迅速置于4%多聚甲醛固定液中固定，部分放入冻存管置于-80℃冰箱保存备用。

2.4 检测方法

2.4.1 一般状态及体质量检测

观察各组大鼠的活动状态、皮毛色泽及精神状态，从药物干预第1周开始，每周测1次各组SD大鼠的体质量，观察各组SD大鼠体质量变化。

2.4.2 血清学检测

全自动生化仪检测空腹血糖（FBG）、糖化学清蛋白（GSP）、甘油三酯（TG）、胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、游离脂肪酸（FFA）。空腹血清胰岛素（INS），计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

2.4.3 HE染色

将大鼠肝脏组织切片用二甲苯、无水乙醇和酒精进行脱蜡，脱蜡后用蒸馏水清洗，然后进行苏木素染色及伊红染色，染色完成后进行透明处理，并用中性树胶封片。最后用显微镜镜检观察SD大鼠肝脏组织形态，并图像采集分析。

2.4.4 Western blot法检测 JAK2、STAT3、Beclin-1、LC3、GLUT2蛋白的表达

大鼠肝脏组织用预冷PBS清洗后分成小块，置于匀浆管中，加入蛋白酶抑制剂，加入RIPA裂解液进行匀浆。后放入裂解液让肝脏组织完全裂解并以12000 r·min-14℃离心10 min得到总蛋白溶液。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测取未变性的蛋白溶液浓度。蛋白质溶液加入5×还原型蛋白上样缓冲液，并置于沸水浴中15 min变性，然后在-20℃冰箱中保存。配置5%的浓缩胶，加入TEMED后立即混合均匀并灌胶，胶制备好后，准备电泳。准备好滤纸和PVDF膜，甲醇活化2 min，在盆里放入转移液，300 mA恒流进行转膜30 min。转模时设备放入冰水中降温。孵育槽中加入TBST，将转印完的膜放入其中，清洗后，加入的脱脂奶粉，然后进行封闭。按说明书稀释并加入一抗、二抗，反复用TBST洗膜直至干净。将PVDF膜的蛋白面朝上置于两膜之间，进行显影和定影，根据不同的发光强度调整曝光条件。

2.5 统计学分析

运用SPSS 25.0统计软件进行分析，数据符合正态分布又符合方差齐性，使用单因素ANOVA分析，不符合正态分布，使用Kruskal Wallis秩和检验。数据采用均数±标准差（）表示，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著意义。绘图应用GraphPad Prism 7软件。

3 结果

3.1 参茸地黄汤对SD大鼠一般状态、体质量的影响

3.1.1 参茸地黄汤对大鼠的一般状态的影响

对照组SD大鼠精神状态良好，反应灵敏，皮毛有光泽；模型组的2型糖尿病SD大鼠倦怠嗜睡，动作迟缓，皮毛脱落无光泽，参茸地黄汤低、高剂量组及盐酸二甲双胍组2型糖尿病SD大鼠活动状态、皮毛色泽以及精神状态方面，均较模型组2型糖尿病SD大鼠改善，精神状态好转，动作灵敏度增加，皮毛脱落减少，整体状况优于模型组。

3.1.2 参茸地黄汤对大鼠体质量的影响

造模成功后，予2型糖尿病SD大鼠参茸地黄汤低、高剂量及盐酸二甲双胍药物干预，从绘制的各组SD大鼠体质量折线图可以看出，对照组SD大鼠体质量平稳上升，模型组、参茸地黄汤低、高剂量组及盐酸二甲双胍组大鼠体质量均呈下降趋势，但各给药组大鼠体质量下降幅度均较模型组减慢（表1）。

3.2 参茸地黄汤对SD大鼠糖、脂代谢的影响

3.2.1 参茸地黄汤对SD大鼠糖代谢的影响

药物干预4周后，与对照组比较，模型组大鼠FBG、GSP、FINS均显著上升（P＜0.05，P＜0.01），参茸地黄汤低、高剂量组及盐酸二甲双胍组可显著降低2型糖尿病大鼠FBG、GSP、FINS水平（P＜0.05，P＜0.01），计算大鼠HOMA-IR，与对照组比较，模型组大鼠HOMAIR显著上升，参茸地黄汤低、高剂量组及盐酸二甲双胍组显著下降（P＜0.01）（表2）。

3.2.2 参茸地黄汤对 SD 大鼠脂代谢的影响

药物干预4周后，与对照组比较，模型组大鼠TG、CHO、LDL-C、FFA均显著上升（P＜0.05，P＜0.01），参茸地黄汤低、高剂量组及盐酸二甲双胍组可显著降低2型糖尿病大鼠TG、CHO、LDL-C、FFA水平（P＜0.05，P＜0.01）。与对照组比较，模型组大鼠HDL-C显著下降，参茸地黄汤及盐酸二甲双胍组可提高HDL-C水平（P＜0.01）（表3）。

3.3 参茸地黄汤对SD大鼠肝脏组织病理形态的影响

对照组SD大鼠肝脏组织整体结构完整清晰,细胞排列紧密有序、大小均匀；模型组SD大鼠肝脏组织细胞排列散乱，可见大量脂肪空泡，细胞间隙扩大；与模型组大鼠比较，参茸地黄汤低、高剂量组及盐酸二甲双胍组大鼠肝脏组织形态结构均有改善（图1）。

3.4 参茸地黄汤对SD大鼠肝脏组织JAK2、STAT3、Beclin-1、LC3、GLUT4蛋白表达的影响

3.4.1 参茸地黄汤对SD大鼠肝脏组织JAK2、STAT3蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与对照组相比，模型组SD大鼠肝脏组织JAK2蛋白表达显著降低（P＜0.01），与模型组比较，参茸地黄汤低、高剂量组及盐酸二甲双胍组JAK2蛋白表达显著升高（P＜0.01），中药高剂量组升高较西药组更为明显（P＜0.01）（图2）。

表1 参茸地黄汤对SD大鼠体质量的影响（，g）

表1 参茸地黄汤对SD大鼠体质量的影响（，g）

注：中药组即参茸地黄汤；西药组即盐酸二甲双胍；与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；给药组与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；中药组与西药组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

给药第4周410.42±7.33 307.21±8.84**329.83±15.06**351.08±16.56**#337.70±8.98**组别对照组模型组中药低剂量组中药高剂量组西药组例数10 8 9 1 0 10给药第1周330.37±4.19 370.40±8.07**364.50±5.74**360.91±8.92**353.46±9.95*给药第2周355.80±4.44 334.12±8.02*345.72±6.68 352.02±8.74 345.32±9.20给药第3周386.40±5.35 321.82±8.01**330.50±8.53**345.40±14.57*337.59±10.83**

表2 参茸地黄汤对SD大鼠糖代谢的影响（）

表2 参茸地黄汤对SD大鼠糖代谢的影响（）

注：中药组即参茸地黄汤；西药组即盐酸二甲双胍。与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。给药组与模型组比较，#P＜0.05，##P ＜ 0.01，参茸地黄汤组与盐酸二甲双胍组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

HOMA-IR 1.81±0.08 11.83±1.35**6.76±0.79**##6.29±1.16**##7.16±0.96**##组别对照组模型组中药低剂量组中药高剂量组西药组例数10 8 9 1 0 10 FBG（mmol·L-1）5.53±0.27 24.36±1.17**19.20±1.73**#14.91±2.59**##17.17±2.11**##GSP（mmol·L-1）1.58±1.12 2.42±0.17*1.96±0.17#1.97±0.12#1.94±0.15#FINS（mU·L-1）7.88±0.12 11.86±0.74**8.91±0.39#8.47±0.56##9.40±1.19#

表3 参茸地黄汤对SD大鼠脂代谢的影响（，mmol·L-1）

表3 参茸地黄汤对SD大鼠脂代谢的影响（，mmol·L-1）

注：中药组即参茸地黄汤；西药组即盐酸二甲双胍；与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。；给药组与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；参茸地黄汤组与盐酸二甲双胍组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

FFA 0.85±0.14 1.46±0.15*1.05±0.09#0.93±0.07##1.24±0.13*组别对照组模型组中药低剂量组中药高剂量组西药组例数10 8 9 1 0 10 TG 0.91±0.12 1.45±0.22*1.06±0.08 1.05±0.07 1.05±0.20 CHO 1.97±1.13 4.72±0.33**3.22±0.14**##3.19±0.11**##3.43±0.16**##HDL-C 1.62±0.20 0.87±0.06**1.05±0.06**▲1.46±0.05##1.49±0.16##LDL-C 0.41±0.05 1.35±0.14*0.62±0.10##0.56±0.4##0.66±0.14##

与对照组相比，模型组SD大鼠肝脏组织STAT3显著降低（P＜0.01），与模型组比较，参茸地黄汤低、高剂量组及盐酸二甲双胍组STAT3显著升高（P＜0.01），其中西药组升高较中药组明显（P＜0.01，P＜0.05）（图2）。

3.4.2 参茸地黄汤对 SD 大鼠肝脏组织Beclin-1、LC3蛋白表达的影响

Western blot 结果显示，与对照组相比，模型组SD大鼠肝脏组织Beclin-1蛋白表达显著升高（P＜0.01），与模型组比较，参茸地黄汤高剂量组及盐酸二甲双胍组Beclin-1蛋白表达显著下降（P＜0.01，P＜0.05），盐酸二甲双胍组Beclin-1蛋白表达水平下降与中药组有显著差异（P＜0.01）（图3）。

与对照组相比，模型组SD大鼠肝脏组织LC3Ⅱ/Ⅰ显著升高（P＜0.01），与模型组比较，参茸地黄汤低、中剂量组及盐酸二甲双胍组LC3II/I显著降低（P＜0.01），参茸地黄汤低、中剂量组的LC3II/I降低较盐酸二甲双胍组更为明显（P＜0.01）（图3）。

3.4.3 参茸地黄汤对SD大鼠肝脏组织GLUT4蛋白表达的影响

图1 各组SD大鼠肝脏组织HE染色（×200）

图2 各组SD大鼠肝脏组织JAK2、STAT3蛋白表达情况

图3 各组SD大鼠肝脏组织Beclin-1、LC3蛋白表达情况

图4 各组SD大鼠肝脏组织GLUT4蛋白表达情况

Western blot结果显示，与对照组相比，模型组SD大鼠肝脏组织GLUT4蛋白表达显著降低（P＜0.01），与模型组比较，参茸地黄汤低、高剂量组及盐酸二甲双胍组GLUT4蛋白表达显著升高（P＜0.01），盐酸二甲双胍组GLUT4蛋白表达水平与中药组比差异显著（P＜0.01）（图4）。

4 讨论

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种慢性代谢性疾病，发病早期症状不明显，往往被人忽视，导致致残、致死率不容乐观[24]。《外台秘要·消渴消中》中记载：“…肾气虚耗故也，下焦生热，热则肾燥，肾燥则渴。”肾气亏耗是消渴病的主要病机，日久气血虚损，脉道不充，气机运行无力，化而为瘀，以致上无法散布津液润泽于肺，下不能气化于膀胱，因此常表现为多饮多食多尿。本研究以“肾虚血瘀”理论指导拟参茸地黄汤以补肾活血，组方鹿茸10 g、熟地20 g、丹参20 g、山药20 g、山萸肉15 g、黄连15 g、茯苓15 g、牡丹皮15 g、骨碎补20 g，且其中多味药被证实有良好的改善2型糖尿病的作用[25-30]。鹿茸性甘、咸、温，归肝肾经，补肾阳、益精血、强筋骨，熟地性甘，微温，入心肝肾经，滋肾阴、补精血，二药合用以补肾益髓，共为君药。丹参苦、微寒，入心肝经，活血通络，山药甘、温、平，入肺脾肾经，健脾补肺，固肾益精，山萸肉性酸、涩、微温，入肝肾经，补益肝肾，收涩固脱，黄连味苦，性寒、归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，清热燥湿，泻火解毒。《名医别录》：“止消渴，利骨”。山药、山萸肉补益三脏之阴，丹参、黄连活血祛瘀，且使补而不滞，五药共为臣药；茯苓入脾肾经，利水渗湿，健脾宁心，牡丹皮入肝、肾经，清热凉血，活血化瘀，二药共为佐药；骨碎补入肝、肾经，补肾强骨，入肾经，引诸药入肾，为本方之使，全方阴阳并补，补中有散，共奏补肾活血之效。

盐酸二甲双胍属于双胍类降糖药物，通过减少糖异生、增加肝糖原储存来治疗糖尿病，研究表明，二甲双胍具有明确的调控自噬的作用[31]。本研究中，STZ联合高脂饲料诱导的2型糖尿病SD大鼠的肝脏组织JAK2、STAT3蛋白水平表达下降，予参茸地黄汤及盐酸二甲双胍后，JAK2、STAT3表达水平上升，其中JAK2蛋白表达参茸地黄汤高剂量组优于盐酸二甲双胍组（P＜0.01），STAT3蛋白表达盐酸二甲双胍组优于参茸地黄汤组（P＜0.05），实验中模型组大鼠的肝脏组织Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高，自噬水平增强，而予参茸地黄汤及盐酸二甲双胍后，大鼠Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平下降，盐酸二甲双胍组Beclin-1蛋白表达下降较参茸地黄汤组明显（P＜0.01），参茸地黄汤组LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达下降优于盐酸二甲双胍组（P＜0.01），各给药组肝脏组织的过度自噬均缓解。在本研究中，模型组大鼠肝脏组织GLUT4表达下降，参茸地黄汤及盐酸二甲双胍给药干预后，各给药组GLUT4表达均提高（P＜0.01），盐酸二甲双胍组优于参茸地黄汤组（P＜0.01），提示糖尿病大鼠肝脏组织的胰岛素抵抗得到改善。

以上研究表明，参茸地黄汤治疗2型糖尿病的机制可能是通过干预JAK2/STAT3信号通路，缓解2型糖尿病SD大鼠肝脏组织的过度自噬，提高GLUT4表达水平，改善胰岛素抵抗实现的，为中医防治2型糖尿病的现代化研究提供参考，但其具体的作用机制有待于进一步研究。