盘基网柄菌RasD蛋白的生物信息学分析及趋电性研究*

王家家, 葛晓雪, 王晓燕, 高晶, 高润池

(1.云南师范大学 生命科学学院,云南 昆明 650500;2.云南大学 农学院,云南 昆明 650500)

Ras是一个小分子的鸟苷三磷酸酶，它能够在与GTP(Guanosine Triphosphate,GTP)结合的活性状态和与GDP(Guanosine diphosphate,GDP)结合的非活性状态之间循环[1].三磷酸腺苷与Ras结合后，激活一系列下游的信号通路，比如有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路和磷脂酰肌醇3-激酶信号通路来促进细胞的存活及分化[2-3].哺乳动物细胞中存在四个Ras蛋白，即H-Ras、N-Ras、K-Ras 4A和K-Ras 4B[4]，研究表明这些Ras亚型的改变能够引起不同细胞的癌变，比如K-Ras突变通常引起结直肠癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌和子宫内膜癌的发生[5]；在黑色素瘤和血液系统恶性肿瘤中，则常常发生N-Ras突变；而肝癌、甲状腺癌和膀胱癌中，H-Ras突变则比较多见[6].

近年来的研究发现，正常组织癌变后，在肿瘤区域产生生物电场，且该电场指导肿瘤的发生发展.然而，由于哺乳动物肿瘤组织的复杂性，人们常常需要借助一些模式生物来研究其中的病理机理，例如盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum).盘基网柄菌是一种低等的真核微生物，具有特殊的单细胞和多细胞生命周期，常作为模式生物来研究真核生物细胞发育、趋化运动和信号传导等[7].盘基网柄菌的单细胞还能够在直流电场发生朝向阴极的定向运动[8]，该现象也被称为细胞的趋电性，因此它也被作为研究细胞趋电性的理想模型[9].研究证明，盘基网柄菌单细胞的趋电性受基因的调控，例如，piaA(PIAnissimo，piaA)和rasG(RAt Sarcoma viral oncogene homolog，rasG)主要调控盘基网柄菌在直流电场中的运动方向[8-10]，Gβ则主要调控盘基网柄菌细胞在直流电场中的迁移速度[11].盘基网柄菌的信号转导通路与高等真核生物非常相似，许多生物信息学分析证明盘基网柄菌可用于研究阿尔兹海默症的发病机理[12]、人类无脑回疾病以及细胞癌变机制[13]、药物作用机理、细胞信号转导和神经退行性病变等[14].

由于盘基网柄菌中存在较多的人类Ras基因家族的同源基因，包括rasB、rasC、rasD、rasG和rasS，因此，盘基网柄菌可作为人类Ras基因的研究模型.本文首先对盘基网柄菌RasD蛋白进行生物信息学分析，再对rasD基因缺陷株的趋电性进行研究，以期为研究哺乳动物肿瘤发病机制提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞

盘基网柄菌细胞(AX2)和rasD缺陷型细胞(rasD-)购自日本National BioResource Project.

1.1.2 氨基酸序列

从UniProt网站上获得盘基网柄菌RasD蛋白的氨基酸序列，通过对RasD(NP_P03967)蛋白序列进行BLASTP比对，获得与之相似的蛋白质的氨基酸序列，其中包括盘基网柄菌RasG(NP_P15064)、人类H-Ras4A (NP_P01112-1)、人类H-RasIDX (NP_P01112-2)、人类N-Ras(NP_P01111)、人类K-Ras 4A (NP_P01116-1)、人类K-Ras 4B(NP_P01116-2)、小鼠(NP_P32883)、果蝇(NP_P08646)、斑马鱼(NP_Q6AZA4)和秀丽隐杆线虫(NP_Q03206).

1.1.3 溶液的配制

HL5培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨 10 g，酵母粉5 g，磷酸氢二钠 0.965 g，磷酸二氢钾 0.485 g，链霉素0.03 g，双蒸水定容至1 L，pH6.5.在121 ℃高温灭菌30 min后，自然冷却，4 ℃保存(6个月).

10×Steinberg′s缓冲液：氯化钠35.064 g，氯化钾0.522 g，硫酸镁1.972 g，硝酸钙0.708 g，三羟甲基氨基甲烷1.696 g，双蒸水定容至1 L ，pH 7.5，室温保存.

DB缓冲液：磷酸氢二钠1.269 g，磷酸二氢钾0.680 g，硫酸镁0.32 g，氯化钙0.022 g，双蒸水定容至1 L ，pH 6.5，室温保存.

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

使用Paragram和ProtScale软件分析该蛋白的理化性质以及亲水性/疏水性.利用MEGA-X软件的近邻相接法(neighbor-joining method,NJ)构建系统进化树.通过PSIPRED软件对RasD的二级结构进行预测.运用软件SWISS-MODEL预测RasD的三级结构.利用STRING网站进行蛋白质互作网络分析(PPI)获得RasD的蛋白网络互作图，分析与RasD发生互作的蛋白质及其发生互作后执行的生物学功能.

1.2.2 细胞趋电性实验及数据分析

取-80 ℃保存的菌株，置于超净工作台上，室温下使其溶解.将菌液转移到装有10 mL HL5培养基的培养皿中，置于22 ℃的恒温培养箱中培养.复苏后的细胞需传代3次后才能进行趋电性实验.

参考文献[8]的方法，当细胞饥饿3 h发生极化后，取适量的细胞种植于特制的加电小室中，贴壁10 min左右后，可对细胞进行加电刺激.电场强度为12 V/cm，并用实时录像系统记录细胞30 min的运动轨迹.用ImageJ软件对细胞30 min内的运动轨迹进行处理和统计，最终获得趋电方向性指数、方向持续性、轨迹速度和位移速度四个参数值.在数据分析时，所有数据至少是三个独立实验的平均值，数据用平均值±标准误表示.使用SPSS软件(SPSS，Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国)进行独立性t检验确定样本处理之间的差异性，P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异.

2 结果与分析

2.1 RasD蛋白的理化性质

软件分析显示RasD含有187个氨基酸残基，分子量为21 201.03，等电点为5.36，负电荷残基数为30，正电荷残基数为26，脂肪酸氨基酸指数为85.99，不稳定指数为45.93，亲水性平均指数为-0.493.亲水性最强的氨基酸位于179，分值为-2.789，这个位点是赖氨酸；疏水性最强的氨基酸位于10，分值为2.144，这个位点是甘氨酸(图1)，亲水性肽链多于疏水性肽链，结合亲水性平均指数为负值，说明 RasD是亲水性蛋白质.

图1 RasD的亲水性/疏水性分析图

2.2 RasD蛋白的同源性及进化分析

盘基网柄菌RasD与人类(Homosapiens)N-Ras相似性最高，为72.29%;与人类H-Ras4A和H-RasIDX相似性分别为70.66%和71.33%；与人类K-Ras 4A和K-Ras 4B的相似性分别为64.92%和70.66%；与小鼠(Musmusculus)、果蝇(Drosophilamelanogaster)、斑马鱼(Daniarerio)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的相似性分别是70.66%、65.45%、70.06%和29.85%.

模式生物Ras蛋白系统进化树如图2所示，盘基网柄菌RasD蛋白与人类亲缘关系最近，与小鼠、果蝇和斑马鱼的亲缘关系较近，与秀丽隐杆线虫的亲缘关系较远.

图2 系统进化树图

2.3 RasD蛋白二级结构预测

RasD的二级结构见图3，RasD属于混合型蛋白，其中α螺旋有87个氨基酸，占46.52%，β折叠有12个氨基酸，占6.42%，无规则卷曲有50个氨基酸，占26.74%.

AA:氨基酸残基; Conf:预测二级结构的可信度;Pred:预测的二级结构;Cart:预测的二级结构的集合.

2.4 RasD蛋白三级结构预测

对 RasD蛋白进行同源建模得到的最佳三维结构模型如图4，RasD蛋白建模图的可信度值为0.79.所得到的三级结构与模板4dst.1有64.86%的一致性，覆盖率达到0.99.

图4 RasD三级结构预测

2.5 RasD蛋白质互作网络分析

RasD的蛋白互作网络(PPI)见图5，分析比较发现RasD参与了许多生物过程(表1)，包括细胞外信号转导的调控、细胞运动、对胞外刺激的调控、趋化性的调控和肌动蛋白聚集的调控等，此外RasD还参与MAPK途径的激活、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的调控和Ras信号转导途径的调控等，说明RasD对于调控细胞的运动非常重要.

图5 RasD的蛋白互作图

表1 RasD参与的生物过程

2.6 rasD缺陷型细胞的趋电性

野生型的盘基网柄菌在直流电场中朝向电场负极运动的现象称为盘基网柄菌细胞的趋电性(图6A).从表2可以看出，在强度为12 V/cm的外源性直流电场中，野生型盘基网柄菌细胞株AX2的方向性为0.79±0.01，轨迹速度为(4.57±0.05)μm/min；rasD缺陷型细胞在相同强度的直流电场中的方向性为0.48±0.01，轨迹速度为(6.10±0.05)μm/min；野生型盘基网柄菌细胞AX2的位移速度是(1.73±0.03)μm/min，而rasD缺陷型细胞是(1.98±0.03)μm/min；野生型盘基网柄菌细胞AX2的方向持续性是0.37±0.004，而rasD缺陷型细胞是0.32±0.004，两者有显著性差异.以上结果表明，盘基网柄菌细胞中的rasD基因不仅参与了细胞的运动，而且还参与调控细胞在电场中对方向的响应.

A:在强度为12 V/cm的外源性直流电场下,野生型AX2细胞的运动轨迹图;B:在强度为12 V/cm的外源性直流电场下,rasD缺陷型细胞的运动轨迹图.

表2 rasD缺陷型细胞的趋电性结果

3 讨论

生物信息学分析表明盘基网柄菌中RasD蛋白序列长度为187个氨基酸残基，属于亲水性蛋白，它与人类Ras蛋白家族成员之间的相似性较高.趋电性实验表明，缺失rasD基因的突变株在强度为12 V/cm的直流电场中朝向负极迁移的方向性显著降低，然而速度却显著增加，说明rasD基因是参与盘基网柄菌细胞趋电性调节的关键基因，但rasD在电场中调控速度和方向的具体机制还有待进一步研究.

生物电信号是一个新兴的研究领域，越来越多的证据表明细胞的趋电性以及由此形成的定向迁移具有较大的应用潜能[15-17].例如，一些研究者尝试用直流电场治疗一些接近浅表部位的肿瘤[11]；或者利用特定频率和强度的交流电场选择性地破坏癌细胞的有丝分裂，从而导致肿瘤细胞凋亡，达到治疗的目的[18]；甚至有一些临床实验已经应用于对脑胶质瘤的治疗[19-20].然而，人们对细胞趋电性机制研究的滞后，限制了临床上对生物电信号的应用.因此，借助一些模式生物来揭示细胞趋电运动的机制势在必行，也是开发生物电信号资源的前提和基础.