两亲性壳聚糖/改性结冷胶复合膜的制备与表征

管晨，周闯，杨子明*，何祖宇，王超，刘运浩，李秀娟，于丽娟，李雪瑞，屈云慧，李普旺*

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430070）（2.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所保鲜重点实验室，广东湛江 524091）（3.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南昆明 650000）

壳聚糖（CS）是甲壳素经脱部分乙酰基产生，呈现双螺旋结果特征[1]。它天然无害、易降解、成膜性佳，因此广泛应用于各种功能高分子材料中[2]。然而，其在水中的溶解性很差，需要在酸性溶液中溶解，导致结构中的氨基质子化（R-NH3+）[3]，这可能在体外和体内应用时引起毒性反应[4]。在现存的各类壳聚糖衍生物中，羧甲基壳聚糖是一种重要的水溶性、生物相容性和生物降解性的物质，有效避免质子化现象并在市场上较易获取[5]。使用羧甲基壳聚糖所制备的可食用性复合膜可以保持食品的固有风味，增加食品的保质期[6]。因此，对壳CS改性具有一定实用价值，使其具备了新的性能，以拓展其应用领域。国内外许多文献中已经对壳CS的改性有了较为细致的研究，如Zhang等[7]将 CS烷基化与氧化石墨复合制备产物,具有较好的生物相容性和力学性能；Wang等[8]改性了五种不同的水溶性季铵盐壳聚糖，该类CS衍生物提升了抗菌性能并有良好生物相容性。根据壳CS的分子结构将其化学改性方法分为酯化、接枝、酰化、席夫碱反应以及季铵盐反应等[9]。胆酸（CA）是天然存在于人与动物体内的有机物，因其化学结构上含有羟基和长链羧基使其具有亲水与憎水的双性质[10,11]，将CA接枝到CS氨基上，可使壳CS具备两亲性，两亲性壳聚糖自组装形成的纳米微胶囊在溶液中稳定存在，可用于包埋难溶于水的物质[12,13]。而单一组分的壳聚糖成膜机械性能差膜脆易断裂，采用聚合物增强力学性能是制备薄膜材料常用的方法之一[14]。

结冷胶（GG）也叫凯可胶是一种天然阳离子多糖，包含摩尔比为 1:1:2的葡萄糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖残基组成的四糖单元线形多糖[15]，它具有高透明、耐酸广、强稳定性、凝胶性、风味释放性、耐高温等性能[16,17]。由于酰基的存在，天然结GG柔软而有弹性[18]，通过添加Ca2+、Na+和K+等阳离子或控制结GG的浓度可以调节聚合物机械性能[19,20]。GG作为一种安全、高效、高性能的凝胶，近年来在医药、食品、日用品等行业得到了广泛的应用[21]。例如GG作为增稠剂、稳定剂应用于酸奶、果酱、果冻布丁、调味料等食品中[22,23]。但GG在常温下溶解易成凝胶的特性使其应用受到限制，羧甲基化改性后，在室温下溶解度增强，结晶度增加，随着表面粗糙度的增加，阳离子诱导的凝胶作用并没有降低生物相容性。本文将制备的水溶性羧甲基壳聚糖中加入CA改性，然后将改性CS与改性GG共混制备成膜，探究其成膜性能。

1 材料与方法

1.1 原料

结冷胶（GG，低酰基）、丙三醇（Glycerol）、壳聚糖（CS，脱乙酰度＞90%）、氯乙酸（Chloroacetic acid），均采购于上海源叶试剂有限公司；异丙醇（Isopropyl alcohol）、氢氧化钠（NaOH）、无水甲醇（Methanol）、无水乙醇（Ethanol），都购买于上海麦克林试剂有限公司；无水胆酸（Cholic acid 98%）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺[1-(3-Dimethylarninopropyl)-3- ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），上海阿拉丁试剂有限公司｡

1.2 仪器设备

傅里叶红外光谱仪，天津港东公司；核磁共振（NMR）仪，苏州纽迈公司；紫外分光光度仪，上海菁华分析仪器有限公司；恒温水浴加热磁力搅拌器，杭州大力科教仪器有限公司；真空冷冻干燥机，北京照生行仪器设备有限公司；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；电子万能试验机，扬州德瑞仪器设备有限公司；热重分析仪，北京北光宏远公司。

1.3 试验方法

1.3.1 羧甲基化壳聚糖的合成

水溶性羧甲基壳聚糖（CMCS）的合成如图1所示，氯乙酸在碱性条件下反应，羧甲基部分取代 CS上的氨基。称取1 g 壳聚糖（CS）加入100 mL三口烧瓶中，加入20 mL异丙醇，于恒温水浴磁力搅拌器上25 ℃下搅拌30 min使其溶胀，然后边搅拌边缓慢滴加20%氢氧化钠溶液进行碱化。称取5 g的氯乙酸溶解于 50 mL蒸馏水中，分批滴加到以上溶液中，60 ℃加热反应3 h。将圆底烧瓶中物质移入烧杯，加入冰醋酸调节pH为7.0，进行抽滤，用无水乙醇多次洗涤，所得产物在冷冻干燥下后得到淡黄色CMCS[24]。

1.3.2 两亲性壳聚糖的合成

两亲性壳聚糖（CMCA-CA）的合成如图1所示，先用氯乙酸在碱性条件下反应，羧甲基部分取代 CS上的氨基，再进行催化CA接枝。按文献方法[25]，称取1 g的1.3.1中制备的水溶性CMCS，加入50 mL去离子水磁力搅拌使其充分溶解。另称取0.25 g的CA，加入无水甲醇充分溶解，分别称取 0.25 g的催化剂EDC和NHS用甲醇溶解。然后，将CA、EDC与NHS溶液分别缓慢滴加到溶解后的CMCS溶液中，室温下搅拌反应24 h。将反应产物用去离子水透析（截留分子质量7000 Da）3 d，最后，将透析后的溶液预冻后再真空冷冻干燥，得到CMCS-CA[26]。

1.3.3 羧甲基结冷胶的合成

羧甲基结冷胶（CMGG）合成如图2所示。称取2 g GG和10 g氢氧化钠加入到50 mL蒸馏水中，在50 ℃下搅拌30 min制备成为水性分散体，磁力搅拌下滴加50 mL浓度为20%氯乙酸水溶液。然后在水浴磁力搅拌下将反应混合物加热至70 ℃，反应30 min，冷却后倒入透析袋（截留分子质量7000 Da），透析3 d，去除多余的氢氧化钠使溶液呈中性，预冻后再进行冷冻干燥得到CMGG。在0 ℃下，当CMGG溶液浓度达到10%以上时，也不会再形成凝胶状[27]。

1.3.4 取代度与接枝率

（1）羧甲基化取代度的测定：羧甲基化取代度通过酸碱滴定法计算[28]。具体步骤如下：新制备的CMGG样品通过透析后冷冻干燥得到。称取1.0 g的CMGG，加入0.1 mol/L的氢氧化钠标准溶液10 mL，搅拌充分溶解，再加入两滴0.5%酚酞。再用0.1 mol/L盐酸标准溶液滴定消耗过量氢氧化钠，溶液变为无色，记录此时盐酸的体积V。

式中：

10-V——每克CMGG所需的氢氧化钠的毫升数。

（2）壳聚糖接枝率：准确称取CS 50 mg，用10 mL 0.5 mol/L的醋酸溶解，待 CS完全溶解后再用 0.5 moL/L的醋酸定容至100 mL。制备CS标准溶液的浓度为0.5 g/L，再准确移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL CS标准溶液加入到10 mL比色管中，并依次分别加入1.0 mL pH值为5.5的醋酸钠缓冲液和1%茚三酮试剂，加去离子水补足5.0 mL。摇匀后于沸水浴加热20 min，直到变为紫色后取出冷却，加蒸馏水定容到10 mL，摇匀，以去离子水为空白在570 nm处测定吸光度[29]。得到吸光度A与样品浓度C的线性回归方程为C=aA+b。按2 mg/mL浓度配制两亲性壳聚糖（CMCS-CA）溶液，分别测定其吸光度，由线性回归方程C=aA+b，可以计算出相应的游离氨基量C，则接枝率Y=100%-C[29]。

1.3.5 两亲性壳聚糖/羧甲基结冷胶薄膜的制备

（1）CMCS-CA水溶液：称取五份0.5 g冷冻干燥得到的CMCS-CA样品于烧杯，加入20 mL蒸馏水，常温磁力搅拌下充分溶解，制备成CMCS-CA水溶液。

（2）CMGG水溶液：以CMCS-CA为标准，称取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g五个不同质量的CMGG样品，加入20 mL去离子水，常温下磁力搅拌充分溶解后制备成CMGG水溶液。

（3）复合膜的制备：将上述的溶液混合，得到CMCS-CA和CMGG为5:0、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5六个不同质量比的复合涂膜溶液，向其中分别加入2%的甘油，磁力搅拌30 min充分混合。将得到的均匀复合膜溶液倒入直径为90 mm玻璃培养皿中，在室温下放置1 h以消除气泡。最后放入55 ℃的鼓风干燥箱中，24 h干燥成膜[30]。

1.3.6 测试与表征

（1）FT-IR测试：采用傅里叶变换红外光谱仪表征。样品进行KBr压片法制备，再从4000 cm-1到500 cm-1波长下进行扫描，扫描间距为 4 cm-1，分别测定CMCS-CA及CMGG的化学基团。

（2）1HNMR分析：分别取一定量CS衍生物及GG衍生物溶于适量的D2O混合液中，待样品完全溶解后进行测定核磁图谱。

（3）热重分析（TGA）：TGA主要用来了解复合物的热稳定，热分解情况的变化。通入氮气在50～600 ℃的温度范围内，以20 ℃/min的速率均匀加热。

（4）透光率：采用紫外分光光度计检测复合膜的透光率，将复合膜尺寸裁剪为10 mm×50 mm的矩形，将膜样品附着在比色皿光滑面外侧，在500 nm下测试膜的透光率，以空气作为空白对照，每个样品均进行三次平行实验。

（5）吸水率分析：将复合膜裁剪成20 mm×20 mm的正方形，烘箱 55 ℃使膜表面干燥，用分析天平进行称量，然后将其放入等重的蒸馏水中，直到形状变化较小无破裂吸水完全，用滤纸蘸去膜表面水分，称重直至恒重，每个样品均进行三次平行实验（同时进行）。

（6）机械性能：将复合膜裁剪为40 mm×10 mm的长条，保存于恒温恒湿试验箱中，测试取出。把样品安装在适合的夹具上，夹具间长度为20 mm，再分别测试每个样品的拉伸性能，拉伸速度为10 mm/min，每个样品均进行三次平行实验。

（7）感官性能评价：通过表面光滑度、揭膜难易、颜色透明度、气味综合评分满分为12分：揭膜难易度分3级评分，即易、一般、难，分值分别为3、2、1分；颜色和透明度分为透明3分，微黄透明2分，黄色透明1分；异味分3级评分，即：有、微有、无，分值分别为1、2、3分；表面光滑度为3级评分，即：好、一般、差，分值分别为3、2、1。

1.3.7 数据统计分析

实验结果中采用Excel软件和MestReNova进行数据处理和分析，Origin 8.5软件作图。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖与结冷胶取代度

GG与氯乙酸质量比 1:5反应产物通过酸碱滴定法测得消耗氢氧化钠标准溶液V=6 mL，CMGG的取代度根据1.3.4公式计算得到DS≈0.84。CMCS的取代度通过酸碱滴定法确定在约80%，再通过茚三酮比色法测定CS原料的氨基含量获得线性回归方程如图 3所示，y=0.00703x+0.04641，R2=0.9992。吸光度A与样品浓度 C的关系为 C=142.2A-6.60，测样品 A为0.12，接枝率为89.54%，CA接枝率约为9.54%。

2.2 壳聚糖与结冷胶衍生物的红外光谱分析

图4为GG和CMGG傅里叶红外图谱的比较，3300 cm-1、2890 cm-1等处的峰属于-OH、-CH2伸缩振动宽展峰；1570 cm-1、1405 cm-1、1050 cm-1等处分别属于C=O、COO-、C-O伸缩振动峰。这些峰强度均有增强。表明，羧甲基成功修饰到结冷胶上。

图5为CS与CMCS及CMCS-CA的红外图谱比较，CMCS中的 3408 cm-1左右的强宽吸收峰为-OH和-NH2的伸缩振动吸收峰，在2920 cm-1左右的吸收峰是C-H键的伸缩振动，1607 cm-1左右和1420 cm-1左右分别对应羧基的不对称和对称吸收峰，1062 cm-1为C-O-C键的伸缩振动峰。在图5中CMCA-CA出现新的峰 1690 cm-1处于酰胺Ⅰ带，酰胺基存在，表示CA接枝成功。

2.3 壳聚糖与结冷胶衍生物的核磁氢谱分析

图6是GG和CMGG的核磁氢谱图。CMGG和GG比较，在4.26×10-6处，出现新的峰，氯乙酸钠中CH2的化学位移为4.30×10-6。表明羧甲基成功修饰到结冷胶上。

图7是CS、CMCS与CMCS-CA的核磁氢谱图，在 CMCS 的1HNMR 中，在 3.50×10-6～4.00×10-6间出现了典型的 C2位取代的羧甲基质子的信号峰（-NHCH2COOH），说明羧甲基被成功接枝到CS上。CS 的特征峰4.75 ppm（糖环 H-1）、3.30×10-6～3.90×10-6（糖环 H-3、H-4、H-5、H-6）。而0.60×10-6～2.00×10-6间出现的多重峰为CA的核磁共振峰，表明在聚合物中有CA基团存在。

2.4 壳聚糖与结冷胶衍生物复合膜的热重曲线图

图8和图9是为CMGG与CMCS-CA不同比例的复合膜的TG和DTG图谱。不同比例的复合膜的热降解过程类似，均分为三个阶段。其中第一阶段温度50～105 ℃加热复合膜，质量减少l0.70%表明复合膜表面所含水分的蒸发，膜中含有的水分（含结合水）的汽化以及成膜体系中增塑剂的挥发吸收热量。第二阶段降解起始点约为150 ℃，最大降解速率在235 ℃左右达到，在400 ℃左右结束，此阶段热降解速率最快。这主要是交联成膜聚合物的降解和成膜焦炭的形成。第三阶段发生在＞400 ℃以上，主要是复合膜对应的碳块的热降解。综上所述，五条曲线的分解过程是连续的，其最大热降解温度分别达到230、260、240、235、235 ℃，CMCS-CA与CMGG的复合膜具有良好的热稳定性。

在图中五个不同比例中热降解过程基本类似，第一阶段除5:3比例外均失重较多，约20%，并且在GG比例不断增多时第二阶段的最大降解速率均推迟，CMCS-CA:CMGG=5:2比例最大降解速率推迟最为明显达到260 ℃左右。因此，CMGG添加到适当比例可以增加CS的热稳定性，提升热降解温度并减缓了其热降解的速率。这一结果的出现是不同的生物大分子间发生强烈相互作用而导致，也可能由于 GG带着负电基团COO-，壳聚糖带正电存在静电相互作用而形成[31]。

2.5 复合膜的透光率和吸水率分析

透光率是指光透过透明体或者半透明体的透过光与其入射光量的百分比。它对人们的视觉效果有直接影响, 尤其是在食品包装领域是较为重要的参考指标。当复合膜应用在果蔬保鲜，要考虑成膜后对果蔬的颜色影响。图10可知CMGG的添加对透光率的影响。紫外分光光度计在500 nm处检测复合膜的透光率，CMCS-CA:CMGG比例为5:0、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5对应的复合膜的透光率为92.20%、86.10%、84%、77.50%、70%、60%。总体上呈下降趋势，当复合膜的透光率达到80%以上，才属于透明性材料。透光率可能因为随着 CMGG含量的增加而下降，因此复合膜的混合比例取5:1、5:2时可保持较高的透光率。

CMGG添加量对CMCS-CA/CMGG复合膜的吸水率影响较大，由图10可知随着CMGG的含量的增加，CMCS-CA/CMGG复合膜的吸水率呈上升趋势。在整个吸水膨胀的过程中发现，复合膜起始吸水速度较快，大约在12 h左右吸水溶胀达到平衡之后变化较小或发生破裂，而纯CMCS-CA在12 h内已经部分破裂溶解无法进行测量称重。上述五个比例复合膜取平衡时吸水率进行比较，CMCS-CA/CMGG比例在 5:4和5:5时吸水率最大，达到700%以上，说明CMGG的加入对复合膜的吸水性影响较大，应该与GG的保水性有关，结合复合膜的透光性能，复合膜的CMGG的比例在5:1～5:3范围内较好。

2.6 机械性能

复合膜的机械性能用拉伸强度和断裂延伸率来表示，对比可见单一CMCS-CA膜的机械性能较差，而添加CMGG的复合膜中CMCS-CA:CMGG的比例为5:2时成膜的机械性能最优，拉伸强度最大为 3.35 MPa，同时其断裂伸长率达到111.0%。适量的CMGG的加入增强复合膜的机械性能，这可能是因为引入了更多的羟基官能团，使其与羟基或氨基官能团相互作用而使膜结合更加紧密[32]。同时适量的增塑剂可使复合膜分子间相互作用更加紧密，从而提高其机械性能。

图11是关于在不同CMGG的添加量中复合膜的断裂伸长率和拉伸强度变化曲线图。从图中可以看出，一定范围内，随着 CMGG的添加复合膜机械性能先升高后下降，添加比例达到5:2时，成膜的机械性能最优，继续添加其拉伸强度和断裂伸长率开始下降，说明 CMGG的添加控制在适当浓度可调节膜的机械性能。

2.7 感观性能

表1 不同比例的复合膜感观质量的影响Table 1 Effect of different proportion of composite membrane on sensory quality

表1对CMCS-CA:CMGG=5:0、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5五个比例的复合膜进行揭膜难易、颜色透明度、表面光滑度（指制备薄膜的表面平整度、厚度均匀性、表面气泡和细小颗粒的多少）及气味的比较[33]。添加 CMGG的复合膜颜色呈淡黄色，随着添加浓度的升高颜色不断加深，透明度降低，达到一定浓度复合膜会产生轻微异味但表面光滑度都表现良好。同时浓度的增加使薄膜更易脱离揭膜，通过感官质量的比较CMCS-CA:CMGG=5:1、5:2的比例复合膜性能表现良好。

3 结论

本文通过 CA与羧甲基化修饰 CS、羧甲基改性GG，然后将CMCS-CA:CMGG按照五个不同比例（5:1、5:2、5:3、5:4、5:5）混合，加入丙三醇为增塑剂，55 ℃，24 h烘干制备成膜。并通过傅里叶红外光谱、核磁氢谱、热重分析、物理机械性能透明度、吸光度、感观质量分析得出以下结论：

（1）CMGG制备的取代度约为 84%左右，CMCS-CA制备条件为选定 80%左右取代度的CMCS，测定 CA接枝率为 9.54%，并以CMCS:CA质量比为4:1，常温，反应时间24 h。

（2）CMCS-CA:CMGG不同比例制备的复合膜热学、力学、光学性能有着显著的差异。在热重分析中CMCS-CA:CMGG=5:2比例的最大降解速率提高最为明显达到260 ℃左右，具有最优的热稳定性。复合膜的力学性能曲线中拉伸强度在 5:2时最大为 3.35 MPa，比其他比例均高，同时其断裂伸长率达到111.00%，复合膜的机械性能达到最优。同时紫外测定5:2比例的复合膜的透明度84%保持较高，感观评定较好。

（3）本研究中对GG进行改性使其具备了易溶于水的性能，同时对CS进行两亲性改性使其直接溶于水并为后续研究中包埋难溶于水的物质打下基础，最后将制备的改性CS与改性GG复合成膜，CMGG的加入改善了CMCS-CA单独成膜的热稳定性与机械性能，同时保持良好的透明度、吸水率和感观质量。