MEBO对大鼠慢性难愈合创面中IL-18表达的影响*

2岑丽君2贺佐分

(1. 右江民族医学院桂西高发病防治重点实验室，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院临床医学院，广西 百色 533000)

皮肤是体表重要的生理屏障，慢性难愈合创面(俗称溃疡) 是指由各种原因引起皮肤损伤后创面修复慢，导致局部皮肤缺失，正常的皮肤解剖和生理状态不完整[1]。随着社会发展，人口老龄化，慢性难愈合创面已演变成一个既古老又新近的医学问题，是目前临床治疗难题。湿润烧伤膏(MEBO)是在中医理论基础上发展起来的一种中成药，在亚洲和中东地区的研究中已证明[2]，其在慢性难愈合创面过程中起着重要的作用，是治疗皮肤溃疡、烧伤的局部药物之一。MEBO可在病灶表面形成保护膜[3]，将伤口保护在一个生理的湿润环境中，提高抗菌、消炎、抗水肿等潜力[4]。慢性创面的愈合实质上是慢性炎症的修复过程，包括缓解炎症反应、溶解和排泄坏死组织、肉芽生成等[4]。MEBO治疗慢性创面的确切作用机制尚未完全阐明，已有研究发现焦亡是一种细胞程序性死亡的过程，其参与多种疾病的发生[5]、发展及预后。焦亡由炎症小体激活后产生Caspase-1[6]，活化的Caspase-1经剪切释放IL-18等炎性因子被认为是细胞焦亡的辅助事件。长期以来细胞焦亡被认为参与了多种炎症性疾病，而MEBO在创面修复中是否涉及细胞焦亡以及其机制尚不清楚。

1 资料与方法

1.1实验动物 12周龄健康成年SPF级Wistar雄性大鼠60只，体重约230 g，购于长沙天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0014。本研究所有程序均按右江民族医学院伦理委员会规定进行。

1.2动物分组及造模 将60只大鼠随机分为：空白组、 急创组、 美宝组、贝复济组、模型组，每组12只。造模方法参照赵京禹等[7]全层皮肤缺损法和沈氏改良塑料环肉芽肿定量法[8-9]。即在大鼠腹腔内缓慢注射10%水合氯醛(3 ml/kg体重)进行麻醉，起效后用电动备皮刀进行背部剃毛，生理盐水擦洗背部皮肤，干燥后以直径30 mm的圆形印章在脊柱两侧做大鼠体表标识，沿脊柱两侧标识线切除皮肤，深达筋膜，覆盖无菌方纱，医用半透明胶布固定。其中空白组为正常大鼠，仅做背部皮肤备皮，急创组直接进行背部造模。美宝组、贝复济组、模型组腹腔内注射剂量为80 mg/kg的醋酸氢化可的松溶液，形成大鼠慢性难愈合创面模型。

1.3创面处理及标本采集 造模成功后用茂康牌稀碘伏溶液消毒创面，其中空白组仅做背部脊柱两侧备皮处理，急创组仅在背部创面湿敷生理盐水纱布。美宝组、贝复济组、模型组分别使用湿润烧伤膏(0.2 g/cm2)、贝复新(60 U/cm2)和生理盐水纱布覆盖治疗。每天换药2次，分别于造模后第3天、第7天、第14天随机将每组4只大鼠脱颈处死。 取造模创面组织置于冰上，使用组织剪剪成均等两片。一片用于制作石蜡切片进行病理学观察；另一半用微量离心管保存置于-80 ℃冰箱，用于分子生物学检查。

1.4观察指标

1.4.1创面细胞观察 电镜下观察急创组、模型组细胞显微结构。

2 结果

2.1各组大鼠创面愈合率比较 治疗后第3天，各组大鼠创面愈合率比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后第7天和第14天，急创组、贝复济组、美宝组大鼠创面愈合率均明显高于模型组(P<0.05) ，美宝组与贝复济组比较差异均无统计学意义(P>0.05) 。见表1。

表1 各组大鼠创面愈合率比较

2.2各组大鼠创面肉眼观及组织学检查情况 造模及干预后第3天，空白组为正常大鼠皮肤结构，各组无明显差异。急创组可见部分痂皮，光镜下(见图1)可见明显皮肤结构损伤，肉芽组织形成，组织水肿明显；贝复济组及美宝组大鼠创面组织内亦可见皮肤损伤，局部可见红细胞溢出血管壁外；第7天模型组创面缩小不明显，局部鲜红，肉芽组织可见暗红，水肿、镜下可见少许出血。其余3组创面较前均明显缩小、创面干燥；第14天，模型组创面愈合不佳，仍见肉芽组织且颜色暗红、局部仍有水肿，镜下仅见部分机化恢复。其余三组均已基本愈合，创面周围有毛发覆盖，急创组愈合最好，创面接近完全闭合(见图2)。电镜结果显示模型组、美宝组中均存在细胞胀大，细胞破损，细胞内容物释放的细胞焦亡特征(见图3)。

2.3IL-18表达水平 治疗第3天、第7天、第14天，空白组为正常大鼠皮肤结构，各时间点IL-18表达水平无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；急创组、贝复济组、美宝组：大鼠创面组织内IL-18表达水平先升高后降低；模型组：第3天到第7天升高，随后逐渐维持在一个较高水平。各组对比情况：第3天：空白组和其余4组差异有统计学意义，模型组和其余4组有统计学差异，急创组、贝复济组、美宝组差异无统计学意义。第7天：空白组和其余4组差异有统计学意义，模型组和其余4组差异有统计学意义，急创组、贝复济组、美宝组差异无统计学意义。第14天：空白组和急创组差异无统计学意义，空白组和美宝组、空白组和贝复济组、空白组和模型组差异均有统计学意义；模型组和其余4组差异均有统计学意义；急创组、贝复济组、美宝组差异无统计学意义。其中模型组在第14天时表达水平为各组最高(见表2、图4、图5)。

空白组：皮肤组织结构清楚饱满，无明显损伤。急创组：第3天出现明显皮肤结构损伤及肉芽组织，第7天肉芽部分机化，第14天机化完全。贝复济组：第3天出现明显皮肤结构损伤，第7天肉芽组织较稚嫩，且可见明显出血，第14天肉芽组织成熟，机化部分恢复。美宝组：第3天出现明显皮肤结构损伤，组织水肿且少量出血，第7天出现肉芽组织，第14天肉芽部分机化。模型组：第3天出现明显皮肤损伤，第7天肉芽部分机化，第14天机化部分恢复。

图2 4组大鼠不同时间点创面情况

图3 电镜下亚细胞形态

表2 各组大鼠创面IL-18蛋白表达水平对比

1：空白组；2：急创组；3：贝复济组；4：美宝组；5：模型组

图5 各组大鼠创面IL-18蛋白表达水平

3 讨论

慢性难愈合创面常好发于创伤、烧伤、瘫痪及糖尿病等，患者普遍高龄，身体状况差，容易造成其他并发症，住院时间增加，伤口长期不适，显著增加了医疗成本[10-11]。随着现代饮食结构和生活习惯的改变，慢性疾病已经成为威胁我国国民健康的头号疾病，慢性难愈合创面就是其中之一。据资料显示[12]，国内每年复杂难治性创面治疗需求在3 000万人次以上，常见有压力性溃疡、糖尿病足、软组织缺损、放射性溃疡等，治疗难度较大，因此，对慢性难愈合创面的研究，寻求一种更加有效的治疗手段，具有重要意义。

慢性难愈合创面由于局部瘢痕形成，血管堵塞，全身静脉用药很难输送至病灶，因此，局部用药成为治疗慢性难愈合创面的重要选择。MEBO在临床中广泛应用于慢性难愈合创面的局部治疗，能保持局部伤口湿润，其中药成分有抑菌消炎，缓解疼痛，促进新生肉芽组织长成的作用，有助于加快创面愈合。焦亡，也称为炎性坏死，是一种具有内在炎症效应的细胞死亡方式，通常由炎性小体触发，经典途径的细胞焦亡依赖于Caspase-1[13-14]的激活，激活后可释放IL-18等炎性因子，已被证明与皮瓣缺血坏死、糖尿病肾小管上皮损伤、溃疡性结肠炎、过敏性鼻炎、牙周炎、酒精性肝炎等多种炎症性疾病有关。课题组前期研究证明MEBO能促进慢性难愈合创面的愈合[15-17]，也对其可能涉及的机制进行了多项研究，但美宝促进慢性难愈合创面中的过程是否涉及细胞焦亡，尚未有涉及，故本研究通过观察细胞焦亡的有关因子IL-18，探讨其可能机制。

研究结果可见：治疗第3天、第7天、第14天，由于空白组为正常大鼠皮肤组织，因此各时相IL-18表达水平无明显变化，差异无统计学意义，与HE染色观察到正常大鼠皮肤结构一致。急创组、贝复济组、美宝组：大鼠创面组织内IL-18表达水平先升高后降低，考虑机体受到创伤后早期炎症反应明显，在贝复新、美宝的干预治疗下，炎症反应到达一定程度后逐渐受控，各种炎症因子释放减少，因此IL-18表达水平逐渐下降。模型组在第3天到第7天升高后可较长时间维持在高水平，与第14天后镜下仍可见颜色暗红、局部水肿和少量炎性细胞及大量成纤维细胞，部分成纤维细胞排列紊乱相符，肉眼观察亦可见模型组愈合最慢，考虑急性炎症可能比慢性炎症引起的炎症反应更加强烈，但没有慢性炎症持久，且在没有药物干预下IL-18检测结果可持续升高。美宝中的黄岑在中医药典记载中就有较广的抗炎作用，由此可以推测美宝、贝复济均有可能通过减少细胞焦亡引起的炎症反应而加快慢性难愈合创面的愈合[18]，且作用相当。同时电镜可看到胞质胀大，细胞膜孔形成的表现，虽然细胞凋亡也可由此类似表现，但结合IL-18表达水平升高，仍支持此为细胞焦亡的亚细胞结构特点。

本研究证实了慢性难愈合创面的修复过程中涉及焦亡，并进一步提供了证据。在目前的研究中，我们发现IL-18炎性因子在慢性难愈合创面中表达升高。同时运用电镜观察到细胞焦亡典型的膜孔破裂形态，气泡生成，这些结果提示细胞焦亡可能存在于创面修复中。

综上所述，MEBO促进慢性难愈合创面的修复过程可能存在细胞焦亡，其机制可能与调控IL-18蛋白表达水平，减少焦亡反应，促进创面愈合，在减少焦亡反应程度与贝复济相似。但本研究具有一定局限性，IL-18除了存在细胞焦亡中，亦可存在其他炎症反应中，因此特异性不够强，其确切机制需要更深入的研究。