囊胚发育速度和形态学参数与整倍体状态及妊娠结局的相关性

陈梦茜，王莹，周林，曹善仁，武恂，凌秀凤，张军强

(南京医科大学附属妇产医院生殖医学中心，江苏 南京 210004)

自1978年第一位试管婴儿诞生至今，辅助生殖技术经历了高速发展的40余年，其培养条件及操作技术日益完善，成功率日趋稳定。近年来，随着囊胚培养技术的发展成熟及玻璃化冷冻技术的完善，为胚胎复苏移植创造了充分条件。如今，辅助生殖技术已经从以往的追求成功率向注重母体和子代的长远健康转变，单囊胚移植在获得较理想的临床妊娠率的同时可以有效降低多胎妊娠率和流产率[1]，实行单胚胎移植已逐渐受到大众的认可。因此，如何选择真正具有发育潜能的胚胎移植成为需要解决的关键问题之一[2-4]。当前的临床工作中，普遍优先选择受精后发育至第5天即形成囊胚，且形态学评分高的胚胎进行移植，但是，当形态学评分和发育时间相互冲突时，如何选择优先移植的胚胎尚存在争议[5-6]。胚胎植入前遗传学检测技术主要包括：胚胎植入前非整倍体遗传学检测(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)，即对于高龄、反复种植失败、复发性流产、不良孕产史等患者做胚胎整倍体筛查；植入前结构重排基因检测，即针对夫妻双方中有一方或双方存在染色体异常，如平衡易位等，检测其胚胎是否具有染色体结构异常；胚胎植入前单基因遗传学检测，即检测胚胎是否有一些可造成单基因病的遗传基因。PGT-A操作复杂、昂贵且有创，并且有严格的适应证；目前，国内仅有少量中心有资质开展PGT-A。传统的胚胎形态学评估方法操作便捷、简单经济且无创，是最常规的评价胚胎发育潜能的方法。如果将两者结合，利用传统胚胎形态学评分的各个关键参数来探索胚胎的整倍体性及后续发育潜能，有望在囊胚移植时更精准地优选胚胎。因此，本研究拟在行PGT-A的患者中，研究囊胚发育速度及形态学评分与囊胚整倍体性及妊娠结局的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2017年10月至2021年1月于南京医科大学附属妇产医院生殖医学中心行PGT-A助孕的患者。纳入标准：符合PGT-A指征；至少有1枚囊胚进行活检并且送检；排除标准：夫妻双方中有一方或两方存在染色体异常；行胚胎植入前单体型连锁分析技术患者；因单基因病行胚胎植入前单基因遗传学检测患者。

1.2 促排卵方案及授精方式

根据患者个体情况采用相应的促排卵方案进行促排卵，取卵日行超声引导下卵泡穿刺术。所有PGT-A周期均采用卵胞质内单精子注射进行授精。卵胞质内单精子注射后置于G1 plus培养液(瑞典Vitrolife公司)中进行培养，受精后16～18 h观察并记录受精情况；双原核为正常受精。

1.3 胚胎培养

待胚胎发育至第3天时观察胚胎的卵裂情况；将全部可用胚胎置于G2 plus培养液(瑞典Vitrolife公司)中进行囊胚培养。

1.4 囊胚观察与活检

囊胚评估采用Gardner评分标准[7]进行评分，分别在第5、6、7天进行观察，选择囊胚扩张程度为4期及以上，内细胞团评分在B级以上，滋养层评分在C级以上的囊胚进行活检。囊胚活检时，在远离内细胞团处用激光对透明带打孔，用活检针缓缓吸入4～5枚滋养层细胞，激发3～4次激光切割细胞连接最薄弱处，使目标滋养层细胞与囊胚分离；将取下的细胞置于PCR管中备检，活检细胞行遗传学检测，检测方法为二代测序；囊胚活检后按每管一枚胚胎进行玻璃化冷冻。

1.5 胚胎移植及随访

子宫内膜准备方案包括自然周期方案及人工周期方案，排卵或黄体转化后第5天行囊胚移植。根据PGT-A检测结果，选择可移植囊胚进行单囊胚解冻移植，术后给予常规黄体支持。移植后14 d测血人绒毛膜促性腺激素，移植后28 d行超声检查，见孕囊及监测到胎心即为临床妊娠。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 患者一般资料

共纳入173例患者的237个PGT-A周期；共活检1 026枚胚胎，其中51枚因扩增失败、无检测信号或结果无法判读而未得到整倍体状态检测结果。在剩余975枚囊胚中，整倍体囊胚为479枚(49.13%)，非整倍体囊胚为496枚(50.87%)。截至2021年1月31日，237个PGT-A周期中，除48个周期无可移植胚胎外，已完成127个周期胚胎移植。

2.2 囊胚发育速度、扩张程度、内细胞团及滋养层级别对囊胚整倍体率的影响

与第5天胚胎相比，第6、7天形成胚胎整倍体率显著降低(P<0.001)，调整年龄后，差异仍有统计学意义(P=0.001)；与4期囊胚相比，5期及6期囊胚整倍体率差异无统计学意义(P=0.061，0.113)，调整年龄后，差异仍无统计学意义(P=0.132，0.109)；与囊胚内细胞团A级别相比，B级别整倍体率显著降低(P<0.001)，调整年龄后，差异仍有统计学意义(P<0.001)；囊胚滋养层B级别与A级别相比，整倍体率差异无统计学意义(P=0.373)，调整年龄后差异仍无统计学意义(P=0.233)；滋养层C级别与A级别相比，囊胚整倍体率显著降低(P=0.001)，调整年龄后差异仍有统计学意义(P=0.001)。见表1。

表1 囊胚发育速度和形态学参数与其整倍体率的关系

2.3 囊胚发育速度、扩张程度、内细胞团及滋养层级别对妊娠结局的影响

共完成整倍体单囊胚移植127个周期，其中第5天移植68个，第6天移植57个，第7天移植2个。调整年龄前，临床妊娠率在不同囊胚形成时间组、不同囊胚扩张程度组、不同内细胞团级别组、不同滋养层细胞组之间差异均无统计学意义(P均>0.05)。

调整年龄因素后，在整倍体囊胚中，不同发育速度的胚胎间临床妊娠率差异无统计学意义(P=0.498)；与移植4期囊胚相比，移植5期、6期囊胚后临床妊娠率差异均无统计学意义(P=0.377，0.550)；与囊胚内细胞团A级别相比，移植B级别囊胚后临床妊娠率差异无统计学意义(P=0.618)；与囊胚滋养层A级别相比，B、C级别临床妊娠率差异无统计学意义(P=0.740，0.995)。见表2。

表2 囊胚发育速度和形态学参数与临床妊娠率的关系

3 讨论

既往研究表明[8-9]，PGT-A整倍体率随女方年龄增长而下降，在女方年龄大于35岁后，下降更为明显；另外，女方年龄是影响妊娠结局的决定性因素。本研究中，有95个活检周期女方年龄大于35岁，因此，将女方年龄作为首要调整因素纳入分析。

国内外有多项研究表明，囊胚扩张程度与整倍体率显著相关，2016年意大利一项研究显示[10]，与1～2期囊胚整倍体率(5.1%)相比，5～6期囊胚整倍体率显著提高(81.1%，P=0.026)；2018年美国一项研究表明[11]，5～6期囊胚整倍体率(48.8%)显著高于3～4期囊胚(32.2%，P<0.01)。上述国外研究的囊胚扩张程度都按1～2期、3～4期、5～6期分组，而国内大多将囊胚培养至4期以上才进行活检。申春艳等[12]研究中4期囊胚占比为90.2%，本研究中4期囊胚占比为88.3%(861/975)，与其相一致，但4期与5期、6期囊胚数量相差悬殊，因此导致相关性无统计学差异。

关于胚胎发育速度与整倍体率的关系，目前的研究呈现两种不同的结果，有研究表明胚胎发育速度与整倍体率无明显相关[10, 13]，也有研究表明第6、7天活检的囊胚整倍体率较第5天低[14-15]；本研究结果与后者一致，这可能与选择标准的不同相关，即本研究严格要求囊胚在发育到4期才会进行活检，而部分研究在第4天即开始活检，且未要求发育至4期。另外，有研究结合时差成像系统观察数据分析，结果显示非整倍体胚胎发育速度更慢[15]。目前临床研究表明，移植第5天囊胚的妊娠率明显高于第6天。研究表明，一些导致胚胎非整倍体的因素，如线粒体或基因表达缺陷、线粒体DNA含量低、纺锤体异常等，都会表现为胚胎发育速度缓慢[16-18]。结合中心质控数据及既往基础和临床研究[19]，南京医科大学附属妇产医院生殖医学中心在实际工作中，会选择优先移植第5天的囊胚，以期获得更好的妊娠结局。

本研究结果显示，囊胚内细胞团及滋养层细胞级别对整倍体率有显著影响；内细胞团B级别的囊胚整倍体率显著低于A级别；C级别滋养层细胞囊胚整倍体率显著低于A级别，B级别滋养层细胞囊胚整倍体率虽低于A级别，但差异无统计学意义，因此优质囊胚的整倍体率高于非优质囊胚。国内外研究均表明[15, 20-21]，囊胚内细胞团和滋养层细胞级别与整倍体性显著相关，级别高者更有可能是整倍体，本研究结果与其一致。因此，胚胎发育早期内细胞团和滋养层细胞状态可作为预测胚胎整倍体结果的重要参考。

对于高龄、反复种植失败、复发性流产、不良孕产史等患者，PGT-A均可有效改善妊娠结局[22-24]；不同指征患者的整倍体率和临床妊娠率均存在差异[24]，高龄患者较复发性流产患者可获得更高的胚胎整倍体率、临床妊娠率和持续妊娠率[25]。在PGT-A患者中，对于移植第5天和第6天的胚胎，两者临床妊娠率和早期流产率均无统计学差异[10]；本研究中移植第5天和第6天的囊胚临床妊娠率也无统计学差异，由此提示在整倍体胚胎中，胚胎发育速度对临床妊娠的影响不大，第5天胚胎和第6天胚胎价值等同，这可以为PGT-A患者在选择胚胎时提供参考。另外，本研究结果显示，在不同的囊胚扩张程度与不同级别的内细胞团、滋养层细胞之间临床妊娠率也无统计学差异。对于未行PGT-A检测的患者，囊胚发育速度、内细胞团级别、滋养层细胞级别可作为确定胚胎移植顺序的参考依据，囊胚扩张程度不作为主要考虑因素，优先选择第5天、内细胞团A级和滋养层细胞A、B级的胚胎。

本研究所有数据均来自同一中心，所有PGT-A均采用二代测序测方法检测，尽可能减少了培养体系和技术相关的偏差。本研究的局限性在于未能结合时差成像系统精准评价胚胎发育速度，且由于样本量的限制，未按不同的病因进行分组分析；另外，由于采集信息时间的问题，部分患者尚未完成分娩，因此仅将临床妊娠作为妊娠结局，分娩结局及新生儿结局有待后续进一步分析。

综上所述，PGT-A周期中，囊胚发育速度、内细胞团等级、滋养层细胞等级与整倍体状态显著相关，囊胚扩张程度与整倍体状态无关；对于早期妊娠结局，整倍体胚胎复苏移植周期的临床妊娠率与囊胚发育速度、内细胞团等级、滋养层细胞等级及囊胚扩张程度均无相关性。