43%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂的HPLC分析

王思威， 常 虹， 王潇楠， 孙海滨， 刘艳萍

(广东省农业科学院 植物保护研究所，广东省植物保护新技术重点试验室，广东 广州 510640)

1 前言

氟吡菌酰胺是拜耳公司开发的吡啶乙基苯酰胺类杀菌剂，主要用于防治蔬菜、水果等作物的病害，作用机理为琥珀酸脱氢酶抑制剂[1-3]。肟菌酯属甲氧基丙烯酸脂类杀菌剂，具有高效、广谱、保护、治疗、铲除、渗透、内吸活性、耐雨水冲刷、持效期长等杀菌特性，对几乎所有真菌纲(子囊菌纲、担子菌纲、卵菌纲和半知菌类)病害如白粉病、锈病、颍枯病、网斑病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性[4-5]。43%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂(商品名露娜森)是由拜耳公司研发的氟吡菌酰胺和肟菌酯复配混合制剂，可同时抑制真菌孢子萌发、芽管伸长、菌丝生长和产孢，与其他杀菌剂不易产生交互抗性，被广泛用于果树、蔬菜上病菌的防治，应用前景广阔。

目前，35%氟吡菌酰胺·戊唑醇悬浮剂、41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂、75%肟菌酯·戊唑醇水分散粒剂等的分析方法有相关报道[3，5-6]，但关于氟吡菌酰胺和肟菌酯混配制剂的分析方法未见公开报道。本文采用高效液相色谱法对试样中氟吡菌酰胺和肟菌酯进行定量分析，该方法操作快速、简便，分离度和精密度均能满足定量分析要求。

2 试验部分

2.1 试剂和溶液 乙腈：色谱纯；水：超纯水；氟吡菌酰胺标准品纯度为99.2%(CHEM SERVICE)；肟菌酯标准品纯度为99.5%(CHEM SERVICE)；43%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂。

2.2 仪器 高效液相色谱仪：岛津LC-20A，带可变波长紫外检测器和自动控温进样器；色谱柱WondaSil C18-WR(150mm×4.6mm，5μm)；过滤器：微孔滤膜，孔径0.22μm。

2.3 高效液相色谱操作条件 流动相：乙腈-水(体积比60：40)；柱温：35℃；流速：1mL/min；检测波长：220nm；进样量：10μL；氟吡菌酰胺保留时间5.67 min，肟菌酯保留时间14.42min。

典型的氟吡菌酰胺、肟菌酯以及43%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂试样液相色谱图(图1～2)。

图1 氟吡菌酰胺和肟菌酯标样液相色谱图

图2 43%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂液相色谱图

2.4 测定步骤

2.4.1 标样溶液的配制 分别准确称取氟吡菌酰胺和肟菌酯标样0.05g(精确至0.000 2g)于不同的50mL容量瓶中，用甲醇溶解，超声振荡5min，定容至刻度，摇匀。用移液管移取上述溶液5mL于25mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，备用。

2.4.2 试样溶液的配制 准确称取0.1g(精确至0.000 2g)样品于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，超声振荡5min，稀释至刻度，摇匀备用。

2.4.3 测定 在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，待相邻2针氟吡菌酰胺和肟菌酯标样溶液的峰面积相对变化<1.5%时，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

2.4.4 计算 将测定的2针试样溶液及试样前后2针标样溶液中氟吡菌酰胺和肟菌酯的峰面积分别平均。氟吡菌酰胺和肟菌酯的质量分数ω(%)按式(1)计算。

(1)

式中：A1为标样溶液中氟吡菌酰胺或肟菌酯峰面积的平均值；A2为试样溶液中氟吡菌酰胺或肟菌酯峰面积的平均值；m1为氟吡菌酰胺或肟菌酯标样的质量，g；m2为试样的质量，g；P为标样中氟吡菌酰胺或肟菌酯的纯度，%；5为标样溶液的稀释倍数。

3 结果与讨论

3.1 检测波长的选择 使用岛津LC-20A的PDA检测器将波长扫描范围调整为190～400nm，对氟吡菌酰胺和肟菌酯标样进行3D谱图扫描，得到氟吡菌酰胺和肟菌酯的紫外吸收光谱图。氟吡菌酰胺在220nm处有较大紫外吸收，肟菌酯在254nm处有较大紫外吸收，(图3)为220nm和254nm谱图比较。综合考虑氟吡菌酰胺和肟菌酯峰型、响应值等因素，选择220nm作为检测波长。

图3 不同波长谱图比较

3.2 流动相的选择 选用WondaSil C18-WR反相色谱柱作为分离柱，分别比较甲醇-水和乙腈-水作为流动相对试样进行检测分析，结果发现，用乙腈-水作为流动相，试样的峰型对称性更好、基线更平稳，更能准确定量分析。

3.3 线性相关性试验 将氟吡菌酰胺和肟菌酯配制成5个系列质量浓度的标准溶液，按照上述2.3的色谱操作条件分析，测定其峰面积，每个质量浓度测定3次，取平均值。以氟吡菌酰胺和肟菌酯的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到氟吡菌酰胺的线性方程为y=215 63x-2 814.4，线性相关系数为0.999 2(图4)；肟菌酯的线性方程为y=506 73x-7 335.8，线性相关系数为0.999 2(图5)。

图4 氟吡菌酰胺线性关系图

图5 肟菌酯线性关系图

3.4 方法精密度试验 从43%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂中称取5份试样，在2.3色谱操作条件下进行分析并取平均值、相对标准偏差(RSD)和变异系数(CV)。结果表明：氟吡菌酰胺的RSD为0.063，CV为0.29%；肟菌酯的RSD为0.091，CV为0.42%(表1)。

表1 分析方法精密度试验结果

3.5 方法准确度试验 称取5份含量的43%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂，置于50mL容量瓶中，分别加入一定量氟吡菌酰胺和肟菌酯标准溶液，在上述色谱操作条件下进行测定，氟吡菌酰胺的平均回收率为100.28%，肟菌酯的平均回收率为100.24%(表2)。

表2 分析方法准确度试验结果

3.6 特异性鉴定 按照2.4.1和2.4.2中方法分别配制标准溶液和样品溶液，按标准中方法对氟吡菌酰胺和肟菌酯进行全波段扫描、峰纯度分析，特异性典型谱图(图6)。从谱图可知，氟吡菌酰胺和肟菌酯在该分析方法下对紫外光有较强的吸收信号。从色谱图中可以清晰看出，有效成分氟吡菌酰胺和肟菌酯出峰处无其他物质干扰，符合定量分析要求。

图6 特异性鉴定(A为氟吡菌酰胺；B为肟菌酯)

3.7 非分析物干扰实验 助剂辅料中干扰物质存在会导致分析方法出现系统偏差，因此，在评价准确度时，需要开展非分析物干扰实验。配制相应空白溶剂溶液、原药溶液、标样溶液及制剂试样，不含助剂的氟吡菌酰胺和肟菌酯的原药按照标准规定的方法进行液相色谱分析(图7～10)，不存在与有效成分的保留时间重合的其他非分析物。因此，按照2.3分析方法分析有效成分，无明显杂质干扰。

图7 空白溶剂色谱图

图8 不含助剂的原药色谱图

图9 标样色谱图

图10 试样色谱图

4 结论

本试验建立了测定43%氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂中2种有效成分含量的分析方法，操作简便、分离度高、线性好，具有较高的精密度和准确度，适用于该制剂的质量检测。