17α- 甲基睾酮对稀有鮈鲫精巢DNA甲基转移酶基因表达的影响

周俊亮，王贤珍，侯晓蕾，杨 琼，陈 越，荣伟雅，刘 青，王伟伟，宋 晶，刘少贞

（1.山西农业大学动物科学学院，山西 太谷 031801；2.山西省水产技术推广服务中心，山西 太原 030002）

环境内分泌干扰物 （endocrine disrupting chemicals，EDCs），又称环境激素，是一类广泛存在于自然环境中的具有类激素生物学效应的化合物，能够导致机体内分泌代谢失衡，引起生物机体繁殖损害［1-2］。 EDCs 来源广泛且产量巨大，各种EDCs 通过人类的生产活动不断释放到环境中，最终进入水体［3-4］。 再加上EDCs 具有不易降解和残留期长等特点，可以在生物体内大量富集，对动物的发育和生殖功能造成巨大的危害［5-6］。

17α-甲基睾酮 （17α-methyltestosterone，MT）化学名17α-甲基-17β-羟基雄甾-4-烯-3-酮，是一种人工合成的白色粉末状具有雄激素效应和作用的化合物，是最具代表性的环境雄激素之一［7-8］。MT 是天然雄激素睾酮（testosterone，T）的17-α 位甲基衍生物， 可引起机体肝脏损伤等， 高浓度的MT 可引起鱼类生长及发育异常［9］。 由于MT 具有广泛应用以及难降解的特性， 大量存在于水环境中，在世界范围内的水环境中均有检出，因此，在2002 年MT 就被列为禁用药物［10］。MT 的作用模式存在两种假说： ①直接通过模拟体内天然雄激素与雄激素受体（AR）结合，影响多种激素的合成和释放。②间接抑制芳香化酶活性，从而引起机体内性类固醇激素水平的改变， 引起鱼类性腺发育不良甚至发生性逆转［11］。

DNA 甲基化是DNA 分子CpG 岛的胞嘧啶（C）第5 位碳原子上加一个甲基，使C 变为5-甲基胞嘧啶（5mC），从而对DNA 进行修饰［12］。 DNA甲基化在动物机体的生长、 发育和调节基因表达等方面起关键作用［13］。DNA 甲基化主要由DNMTs（编码基因：dnmt1、dnmt3、dnmt4、dnmt5、dnmt6、dnmt7、dnmt8）和TETs（编码基因：tet1、tet2、tet3）两个酶及一个底物即甲基供体S-腺苷蛋氨酸（Sadenosyl-L-methionine，SAM）调控［14］。 哺乳动物有3 种DNMTs：DNMT1、DNMT2 和DNMT3［15］。DNMT1 起维持DNA 甲基化的作用， 在细胞分裂中复制甲基化［16］。 DNMT2 目前研究较少，可能与RNA 甲基化有关［15］。 DNMT3 参与DNA 从头甲基化过程，能够在DNA 的某些区域引入新的甲基［14］，包括DNMT3A、DNMT3B 和DNMT3L。而有学者研究发现斑马鱼体内DNMT3 家族有DNMT3、DNMT4、DNMT5、DNMT6、DNMT7 和DNMT8 6 种不同的亚型［17］。

EDCs 可以引起基因启动子区域的DNA 甲基化的改变，影响基因的转录调控［18］。 前期研究表明，雌二醇（EE2）和甲基睾酮（MT）能够改变稀有鮈鲫精巢和卵巢cyp17a1 启动子区DNA 甲基化水平，影响cyp17a1 的表达［19］。DNA 甲基化水平变化的同时dnmts 表达量会发生改变，1 mg/L 的双酚A（BPA）暴露斑马鱼（Danio rerio）可引起斑马鱼性腺DNA 甲基化水平的降低和基因dnmt1 表达量的下降［20］，dnmts 表达可以直接对DNA 甲基化进程产生影响，因此，dnmts 调控是调节DNA 甲基化的重要途径。

稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）属鲤科鮈鲫属，是我国特有物种，个体全长3～8 cm［21］。稀有鮈鲫具有饲养简单、繁殖快、对环境污染和化学品敏感等特点，广泛应用于遗传学、生理学、生物监测、毒性测试等领域， 是我国迄今发现的最适合作为实验动物的鱼类［22-24］。 大量研究表明，稀有鮈鲫对EDCs 十分敏感，BPA、EE2、苯并芘（BaP）等环境内分泌干扰物会扰乱稀有鮈鲫的生殖过程［19，25-26］。稀有鮈鲫是2010 年中华人民共和国生态环境部《新化学物质申报登记指南》中指定的本土实验生物［27］。

该研究选择稀有鮈鲫雄鱼为研究对象， 研究不同浓度MT 对稀有鮈鲫精巢中DNA 甲基转移酶基因表达的影响， 以期为MT 影响稀有鮈鲫精巢发育及精子成熟的调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物为山西农业大学水产科学系实验室繁殖的同一批6 月龄稀有鮈鲫 （G. rarus）雄鱼，从中挑选体格匀称且健康的平均体长（3.45±0.25）cm、平均体重（0.71±0.09）g 的个体作为试验材料。

1.2 试验试剂及仪器

17α-甲基睾酮 （MT， 纯度＞99%） 购自美国Sigma 公司。RNA 提取试剂（RNAiso Plus）、反转录试剂盒 （PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）和实时荧光定量试剂盒（TB GreenRPremix Ex TaqTMⅡ）购自日本TaKaRa 公司。 核酸蛋白检测仪（ND1000，NanoDrop 公司），PCR 扩增仪（ABI公司），实时荧光定量PCR 仪（CFX ConnextTMReal-Time System，Bio-Rad 公司）等。

1.3 MT 处理稀有鮈鲫雄鱼

试验共设4 个组，1 个对照组和3 个MT 处理组（25、50 和100 ng/L），对照组为0.001%（V/V）无水乙醇水溶液， 各组均设置3 个重复。 每个缸里36 尾稀有鮈鲫雄鱼。 该试验采用半静水暴露的方法，养殖用水pH 值为7.6 左右。 保证饲养密度小于1 g 鱼/L 水，每天吸污（残饵和粪便）的同时换掉水族箱一半的水， 并加入等量的水和相应量的MT 溶液，保证水族箱里MT 浓度不变。 每天早晚定量投喂红虫各1 次。 试验期间保持养殖环境安静， 减少试验鱼的应激反应， 水温控制在 （25±1）℃，光周期14 h∶10 h（明/暗）。

1.4 取样

分别在7、14 和21 d 暴露结束后， 对各组稀有鮈鲫进行解剖，取样前一天晚上停止喂食，保证取样当天稀有鮈鲫处于空腹状态。 每次随机捞取10 尾鱼，采用MS-222 将鱼麻醉后，摘取稀有鮈鲫精巢（n=10）放在Trizol 里研磨并充分裂解，随后放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.5 总RNA 提取及cDNA 的合成

采用Trizol 一步法提取稀有鮈鲫精巢总RNA，以总RNA 为模板，按照反转录试剂盒使用说明书合成cDNA。

1.6 定量引物合成

参考刘琰［26］的研究合成稀有鮈鲫dnmt1、dnmt3、dnmt4、dnmt5、dnmt6、dnmt7、dnmt8 以及内参基因β-actin 的定量引物（见表1）；首先使用普通PCR 检测引物扩增条带，确认扩增产物条带单一，无二聚体，可用于后续试验。

表1 实时荧光定量PCR 引物序列［26］

1.7 数据处理

试验数据的表示方法为平均值±标准误（Mean±SEM）， 目的基因的表达量为相对表达量，用F=2-ΔΔCt的方法进行计算。 使用IBM SPSS Statistics 21.0 对试验数据进行独立样本t 检验统计分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果

MT 处理稀有鮈鲫雄鱼7 d，dnmt1、dnmt4、dnmt6、dnmt8 基因相对表达量均无显著变化 （见图1A、C、E、G）； 与对照组相比，25 ng/L 和100 ng/L的MT 处理组，dnmt3 基因相对表达量显著 （P＜0.05） 降低，50 ng/L 的MT 处理组稀有鮈鲫精巢dnmt3 基因相对表达量极显著（P＜0.01）降低（见图1B）；25 ng/L 和50 ng/L 的MT 处理组，dnmt5 基因相对表达量显著（P＜0.05）降低（见图1D）。 dnmt7基因相对表达量只在50 ng/L 的MT 处理组显著（P＜0.05）降低（见图1F）。

MT 处理稀有鮈鲫雄鱼14 d，25 ng/L 的MT 处理组，所有基因表达量无变化（见图1）。50 ng/L 的MT 处理组dnmt1 基因相对表达量极显著 （P＜0.01） 升高 （见图1A）。 100 ng/L 的MT 处理组，dnmt3、dnmt5、dnmt6、dnmt7 基因相对表达量显著（P＜0.05）升高（见图1B、D、E、F）。

MT 处理稀有鮈鲫雄鱼21 d， 与对照组相比，50 ng/L 和100 ng/L 的MT 处理组dnmt1 基因相对表达量显著（P＜0.05）升高（见图1A）；dnmt8 的mRNA 表达量极显著（P＜0.01）升高（见图1G）。

图1 MT 对稀有鮈鲫精巢dnmts 基因表达的影响

3 讨论

近年来，越来越多的研究人员开始关注DNA甲基化在有毒物质对机体影响中的调控作用［28-29］。DNA 甲基化能引起染色质结构、DNA 构象、DNA稳定性及DNA 与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，在真核生物中，CpG 岛上第5 位胞嘧啶碱基上的甲基化是由DNA 甲基转移酶（DNMTs）催化的［30］。 表观遗传机制可以深刻地改变转录和翻译的生物学过程， 在调节生物体对毒物的反应中发挥重要作用［29-30］。 DNA 甲基转移酶（DNMTs） 是调控DNA 甲基化主要酶类，DNMTs酶活性的变化会引起DNA 甲基化水平的改变，而DNMTs 是由dnmts 基因编码的［30］，用二氯酚暴露金鱼后，肝脏的总DNA 甲基化水平升高，DNA 甲基转移酶（DNMT）mRNA 水平的上调，说明dnmts基因表达量的升高会使DNMTs 酶活性增强，进一步导致DNA 甲基化水平升高［31］。该研究结果表明短期MT 暴露（7 d），稀有鮈鲫精巢dnmt3 和dnmt5 容易受到影响，这说明dnmt3 和dnmt5 对外源性雄激素较为敏感。任何因素导致的DNMTs 酶活性的变化可能引起DNA 甲基化水平的改变［32］，由此推测MT 可以通过改变dnmts 基因表达从而影响DNMTs 酶活性，进一步影响稀有鮈鲫精巢发育及精子成熟。

研究发现邻苯二甲酸二乙基己酯 （DEHP）暴露大鼠会显著提高子代大鼠睾丸的DNA 甲基化水平和dnmts 表达，引起子代大鼠睾丸发育不全［33］。环境相关浓度BPA 暴露斑马鱼， 结果发现dnmt1的表达降低以及总体DNA 甲基化水平降低［34］。在对罗非鱼（Oreochromis mossambicus）的研究中发现，dnmts 家族具有高度的保守性， 且在精巢中高度表达，同时发现，甲基转移酶抑制剂显著下调罗非鱼性腺dnmts 基因表达， 说明了甲基转移酶抑制剂通过抑制dnmts 基因表达而抑制DNMT 酶活性，进而降低罗非鱼性腺DNA 甲基化水平［35］。 阿特拉津（atrazine）处理鲤鱼（Cyprinus carpio）会使得性腺dnmts 基因mRNA 和整体DNA 甲基化水平降低［36］。环境雌激素双酚A 处理斑马鱼，处理组性腺中dnmt1 和dnmt3 基因相对表达量升高，性腺整体甲基化水平升高， 从而抑制类固醇激素合成相关基因的表达，进一步增加卵巢中细胞凋亡，抑制卵细胞成熟［22］。综上所述，不同类型的环境内分泌干扰物通过影响性腺中dnmts 基因表达，而影响性腺甲基转移酶DNMT 活性， 进一步影响性腺发育。

该试验结果表明，MT 可以改变dnmts 基因mRNA 表达。MT 是否可以通过影响DNMT 酶活性而影响精巢DNA 甲基化水平，进而抑制稀有鮈鲫精巢发育及精子成熟，需要验证。