热休克蛋白70与慢性阻塞性肺疾病相关性研究进展*

凌忠满 罗维贵

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常见的慢性气道疾病，严重危害人类的健康安全和影响生命质量，是导致死亡的重要原因，并给患者以及社会带来沉重的经济负担。2018 年调查显示，我国20 岁及以上成人COPD 患病率约为8.6%，40 岁及以上人群患病率高达13.7%，由此估算我国患COPD 总人数近1 亿[1]。随着愈发严峻的环境空气污染、吸烟率高和人口老龄化等因素，COPD 的发病率逐年上升，成为全球范围内发病率和死亡率最高的疾病之一。世界卫生组织（WHO）对全球健康评估报告显示，截至2019 年COPD 已成为世界第三大死亡原因[2]。根据全球疾病负担（GBD）数据研究结果显示，COPD 患病率预计在未来25 年时间将持续升高[3]，持续成为世界性公共卫生问题。

COPD 的发病机制复杂，目前认为COPD 发病机制有气道氧化应激、炎症反应及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等，与多种因素密切相关，如吸烟、空气污染、职业粉尘和化学物质、感染因素、免疫应答、年龄、气道高反应、自主神经功能失调等，其中吸烟为最主要的危险因素。热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一类多功能且高度保守的应激反应蛋白[4]，而热休克蛋白70（heat shock proteins70，Hsp70）是HSPs 中最为保守、最为重要的一员，在高温、缺氧、缺血、感染、吸烟、免疫反应等应激状态下可被诱导提高表达水平，起到保护细胞的作用，被认为参与COPD 的发病机制而受到关注。近年来研究发现Hsp70 可作为COPD 疾病诊断和判断治疗预后的生物指标。本文对Hsp70 在COPD 的相关研究进展予以综述，旨在为后续相关研究提供参考。

1 Hsp70的概述

1.1 Hsp70 的结构 据报道，在人类中的Hsp70 家族有多达13 个成员，虽其在细胞内外的场所有所不同，但均有共同的域结构[5]。Hsp70 由一个保守的含有三磷酸腺苷（ATP）酶活性的氮末端核苷酸结合结构域（NBD）和一个不太保守的带有底物结合位点的碳末端底物结合结构域（SBD）组成，NBD 和SBD 则通过一个带电和高度保守的接头相连接[6-7]。NBD 分为两个叶（Ⅰ和Ⅱ），进一步分为四个子域，即ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB。SBD 由包含底物结合裂缝的β 夹心结构域（SBDβ）和调节蛋白质（即底物）亲和力的α 螺旋“盖”结构域（SBDα）组成，SBDα 作为SBDβ 的盖子，促进底物的稳定结合[8]。接头作为负责NBD 和SBD 变构的信息传导控制元件，由7～13 个残基组成，其主要表现为疏水性。由于接头的核酸片段的长度较短，若其中核酸序列发生变异就会对其结构、功能及NBD 和SBD 之间变构调节产生重要影响。因此，Hsp70 接头调节Hsp70 的结构功能特征，包括其整体构象、对肽底物的亲和力以及与共同伴侣的相互作用等[7]。

1.2 Hsp70 的分布及功能 Hsp70 是Hsp70 家族的诱导成员，在大多数无应激状态下的正常细胞和组织中以低水平或不可检测的水平表达，但在各种应激状态下被快速诱导表达，主要分布在细胞核、线粒体及内质网中[9-10]。Hsp70 在细胞受到热休克、感染、炎症等因素刺激后被诱导表达升高，通常在细胞内作为重要的分子伴侣，广泛参与蛋白质稳态和质量控制，监督蛋白质的运输和跨膜转运，降解修复错误折叠的蛋白质，与共同伴侣协同作用维持蛋白质组的稳态[11]。Hsp70 除了抑制细胞凋亡、抗炎作用以外，还与肿瘤细胞增殖和迁移密切相关[12-13]。此外，Hsp70 在细胞受到损害应激时表达升高，促进细胞修复和延长生命，其表达减少则促进细胞凋亡，因此被认为是细胞寿命的潜在生命标记物[14-15]。后来在一些正常和病理状态下的个体的细胞外环境中发现Hsp70，细胞外Hsp70 才逐渐进入了人们的视野。最初认为细胞外Hsp70 来源于细胞内，是由细胞裂解后被动释放到细胞外[16]，后来相关研究表明细胞在应激条件下可通过非经典途径主动分泌释放[17-19]。细胞外Hsp70 在体液中以游离形式存在，在低水平时促进免疫反应，发挥保护细胞功能，但一旦超过某一临界阈值后则增强炎症反应[20]。

2 Hsp70与COPD的相关性

2.1 Hsp70 抗氧化应激作用减轻COPD 肺细胞损伤 众所周知，氧化应激增加是COPD 发病的关键机制[21]。氧化应激是机体或细胞内氧化物质产生或外源性氧化物质摄入过多与清除失衡，引起机体或细胞内促氧化因子蓄积的一种病理状态，可导致线粒体脱氧核糖核酸（DNA）损伤和细胞损伤[22]。受到外源性因素刺激后，COPD 患者的呼出气冷凝物、血清和体循环标本中氧化应激标记物水平增加[23-24]。引起COPD 呼吸道氧化应激的原因不仅包括吸入的香烟烟雾及其他刺激物，还包含被激活的炎症反应细胞[23-24]，其中香烟烟雾是最重要的致病因素[1]。香烟烟雾中含有种类繁多的氧化剂诱发气道氧化应激，促进COPD 的发展。气管上皮细胞受到香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激后，Hsp70 表达水平上升增强细胞抗氧化应激能力，抑制线粒体膜电位的丢失，减少中性粒细胞对气道炎症的反应[25]。线粒体为调控细胞能量、氧化还原及信号传导的重要细胞器，Hsp70 阻断线粒体膜透化，有效抑制蛋白质聚集及降解错误蛋白。细胞内氧化还原敏感系统的NRF2/KEAP1 信号通路和抗氧化防御基因多态性与COPD 的发病机制存在密切关联[26]。当细胞受到氧化应激后，NRF2/KEAP1 复合物分解并诱导抗氧化防御基因的表达[27-29]。NRF2 作为转录因子调控COPD 抗氧化基因的表达，KEAP1 作为衔接蛋白介导NRF2 调控作用[30]。动物实验结果表明，CSE 和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）联合可诱导下调COPD 大鼠肺组织NRF2 蛋白的表达和NRF2 转录调控的抗氧化酶的表达，增加8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）表达水平[31]。另外，CSE 对人气道平滑肌细胞的毒性作用显著增加8-OHdG 水平、DNA 损伤和细胞凋亡，并且降低Hsp70 的生成，Hsp70 表达水平与8-OHdG、DNA 损伤和细胞凋亡呈负相关[32]。其中8-OHdG 是评价氧化应激中DNA 氧化损伤的重要生命标记物。因此认为，Hsp70 可能参与COPD 的抗氧化基因的调控，通过NRF2/KEAP1 信号通路发挥抗氧化作用，参与了COPD 的发病机制，保护细胞抵抗CSE 的氧化应激损伤，降低气道细胞暴露在CSE 引起的相关气道疾病，维持细胞正常功能，这对于减少气道损伤阻断COPD 疾病的发生与进展有重要作用。

2.2 Hsp70 参与COPD 的气道和全身炎症反应 COPD的本质是炎症性疾病，多种炎症细胞参与COPD 的气道炎症，被激活的炎症细胞释放多种炎症介质作用于气道上皮细胞，尤其是COPD 急性加重时炎症细胞聚集、炎症因子的大量释放，诱导气道上皮杯状细胞化生和气道黏液分泌增加，炎症因子刺激气道周围平滑肌和成纤维细胞增生导致小气道重塑，加重气流受限程度。此外，COPD 存在全身系统性炎症，即肺外炎症，与疾病的进展和并发症有关[33]。Hsp70 具有稳定的抗炎作用，广泛参与到COPD 发病的气道炎症反应中，一方面作为伴侣蛋白发挥抗炎作用，另一方面又分泌到细胞外作为炎症介质激活先天免疫和炎症反应[20，34]。有研究分别将浓度为2.5%和15%的CSE 与重组人热休克蛋白70（rhHsp70）组合处理作用于支气管上皮NCI-H292 细胞观察炎症反应，结果显示2.5%CSE组合rhHsp70 减少了细胞因子的分泌，原因可能是rhHsp70 消除了2.5%的CSE 诱导TLR2 和TLR4 基因的表达，抑制白介素1α（IL-1α）、白介素6（IL-6）和白介素8（IL-8）等细胞因子的分泌，而15%的CSE 与rhHsp70 组合则显示促炎作用，并且增加细胞内Hsp70 mRNA 的表达，认为rhHsp70 通过MAPK 和NF-kB 信号通路调节CSE 对NCI-H292的炎症反应[35]。另外，在COPD 肺供体分离的原代支气管上皮细胞中也证实了细胞外Hsp70 通过Toll 样受体激活免疫细胞并诱导合成IL-6 和IL-8，增强了CSE 刺激炎症反应[35]。以上研究结论表明Hsp70 在参与COPD 炎症反应中似乎表现为“双重作用”，即既在气道炎症反应中主要表现为抗炎，而在细胞外则有抗炎和促炎作用。目前认为细胞外Hsp70 主要作用是促炎还是抗炎取决于细胞类型和炎症环境以及细胞内和细胞外Hsp70 的浓度比。但到目前为止，可以确定的是细胞外Hsp70 与香烟引起COPD 气道炎症有关，其表达水平可以反映全身炎症应激状态，在一定程度上可以反映COPD 的严重程度[36]，但还没有相关研究报道确定细胞外Hsp70 的具体浓度参数对决定其参与COPD 炎症反应的强度或属性。

2.3 Hsp70 作为分子伴侣提高肺细胞抗凋亡能力 肺细胞损伤或凋亡是COPD 发病的重要促进因素。持续的气道慢性损伤刺激气道上皮细胞增生、化生及分泌增加，蛋白酶破坏组织结构及颗粒酶穿孔素损伤肺泡上皮，细胞损伤触发凋亡程序导致凋亡。当一定数量的肺泡细胞凋亡又不能被新生正常的细胞充分替代，可造成肺泡功能受损和整个肺泡的破坏，最终导致COPD[37]。在显微镜下观察COPD肺组织病理可见肺实质破坏、呼吸性细支气管的扩张和破坏，肺泡壁变薄，肺泡腔扩大、破裂或形成肺大泡，血液供应减少。因此，研究Hsp70 抗凋亡蛋白或与相关辅助蛋白相互作用抑制肺实质细胞凋亡对减少COPD 发病率及疾病进展具有重要意义。Hsp70 已被证实具有抗凋亡功能的分子伴侣，具有识别和指导蛋白质多肽正确合成的作用，参与新生多肽的折叠、运输和降解，降低各种应激条件下对细胞的有害影响，有利于维持细胞稳定和保持生命力，促进细胞存活[38]。Hsp70 可通过受体介导、线粒体介导或细胞信号通路等途径发挥抗细胞凋亡的作用[39-41]。Hsp70 含量减少或Hsp70 敲除后细胞的生存力下降，蛋白稳态破坏和加速细胞凋亡过程[15，42]。因此，肺实质细胞内维持一定水平的Hsp70 表达促使细胞在感染、炎症、烟雾、缺氧等各种有害损伤后仍保持生命力减少凋亡，保持呼吸性细支气管和肺泡功能，对减少COPD 患病具有重要意义。

目前关于Hsp70 如何发挥保护细胞作用抵抗细胞凋亡参与到COPD 发生机制仍在研究中。各种原因引起细胞蛋白稳态失衡导致某些病态蛋白质在内质网有害积累引起内质网应激与COPD 的发展有关[43-44]。据报道，Hsp70 参与了内质网应激机制，在气道炎症反应中发挥作用[9]。减少内质网应激可以降低或缓解COPD 疾病的风险，研究表明腺苷酸激活蛋白酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通过激活FOXO1 上调氧调节蛋白150（ORP150）转录，抑制FOXO1 促进细胞凋亡的通路，减少内质网应激及降低炎症因子的分泌，减少细胞凋亡以实现保护气道的作用[45]。AMPK 是细胞能量状态的关键传感器，当细胞受到应激时AMPK 被激活磷酸化，通过降低炎症因子IL-8 分泌的途径在COPD起到保护作用。另外内质网应激的重要标志是抗凋亡分子伴侣ORP150 的激活，ORP150 可以接受白藜芦醇（激动剂）激活拮抗支气管上皮细胞暴露于CSE 后诱导内质网应激诱导的凋亡过程[46]。白藜芦醇诱导Hsp70 启动子调节的血管内皮生长因子（VEGFA）表达，减轻弹性蛋白酶分泌导致的肺气肿，显著改善了小鼠COPD 疗效[47]，这为临床治疗COPD 提供了新思路。

2.4 Hsp70 与肺功能的关系 COPD 的特征是持续存在的气流受限和相应的呼吸系统症状，气流受限恶化成不可逆的气流受限是COPD 病理生理的核心特征，表现为第一秒用力肺活量（FEV1）/用力肺活量（FVC）及FEV1降低。气流受限的原因为气道持续受到各种刺激后发生结构上改变，特别是终末呼吸性细支气管，气流在小气道阻力增加，肺泡扩张后弹性回缩力下降。根据COPD 的诊治指南，肺功能检查是诊断COPD 的“金标准”，也是评估疾病严重程度、监测疾病进展、评价预后及治疗反应最常用的客观指标。据报道，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）基因的多态性可能与肺功能的下降有关[48-49]，MMP 可破坏肺结缔组织的弹性蛋白，损伤肺上皮细胞引起肺气肿，其在肺组织中的表达升高与Hsp70 相互作用共同参与调解肺组织的重塑[50]。在COPD 患者的肺组织中检测到Hsp70 在基因和蛋白质水平上的表达增加，并且Hsp70 表达升高与COPD 的严重程度和吸烟状况密切相关，被认为是反映炎症严重程度和疾病进展的生物标记物[51]。COPD 具有异质性，仅参考Hsp70 单一生物标记物不足以准确评估病情，还需要结合其他生命标记物或检查指标，如其他炎症指标、肺功能等。一项研究表明，COPD 患者血浆中的Hsp70 浓度与支气管气流受限的严重程度、症状负担和恶化史呈正相关，与肺功能FEV1和FEV1/FVC 呈负相关[52]，原因是COPD 病情加重时机体和气道炎症反应、氧化应激程度加重，激活机体免疫反应，Hsp70 应激表达增加作为内源性保护蛋白协助蛋白修复，降低氧化损伤。血清中Hsp70 与IL-1β、ATP 等多参数对识别COPD 患者具有重要的预测价值，尤其综合肺功能多参数对识别COPD 急性加重期（AECOPD）具有重要临床意义。因此，根据血清中Hsp70 表达水平结合临床上检测的炎症指标、肺功能等多参数综合评估COPD 病情严重程度、治疗反应及预后。

3 总结与展望

研究证实了Hsp70 参与了COPD 的发病过程，但其具体机制及影响因素需要进一步研究。在一些实验中，细胞内和细胞外Hsp70 均可表现出抗炎作用，细胞内Hsp70 还具有抗氧化应激、抑制细胞凋亡作用，检测血清中Hsp70 可以评估COPD 的病情。Hsp70 广泛参与COPD 的发病机制，各种调节Hsp70 生物活性的因素，如激动剂和抑制剂等在干预COPD 的发生发展、靶点治疗及改善预后等方面有待进一步研究。