中国西北地区汉族苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变分析

何 江，强 荣，毛新梅，王慧珍，闫有圣，邹红云，史清海*

(1.新疆军区总医院 检验科，新疆 乌鲁木齐830000；2.陕西省妇幼保健院 医学遗传中心，陕西 西安710003；3.宁夏回族自治区妇幼保健院 新生儿疾病筛查中心，宁夏 银川750011；4.青海省妇幼保健院 新生儿疾病筛查中心,青海 西宁810000；5.甘肃省妇幼保健院 医学遗传中心，甘肃 兰州730050)

苯丙酮尿症(PKU)是一种常染色体隐性遗传病，属于苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏症之一，是PAH基因突变导致酶活性降低或丧失，苯丙氨酸(Phe)在体内无法正常代谢而异常蓄积及其旁路代谢产生的有害性代谢物质引起患者严重智力低下及神经行为异常[1]。目前，在PAH基因的13个外显子(exon，E)以及内含子(intron，I)、5′非翻译区(5′-UTR)和3′非翻译区(3′-UTR)等区域发现有错义突变、小缺失、剪切位点突变、沉默突变、无义突变、小插入及大片段插入等致病突变形式[2-3]。截至2020年7月22日，世界范围内报道的PAH基因突变已达1188种(http://biopku.org/pah/search-results-browse.asp)，不同国家和民族的PAH基因种类和频率差异明显，这为全面阐述各地区及种族PKU发病的分子机制奠定了遗传基础。本研究对西北地区确诊的223例汉族PKU患儿进行PAH基因突变分析，旨在探究西北地区汉族PKU患者PAH基因的突变规律及分布特点，归纳总结出西北地区汉族PKU患者的PAH基因突变谱，对于指导本地区产前诊断、携带者筛查及了解PAH基因的进化、漂移非常重要，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料来源选取2003年1月-2019年8月经西北五省区新生儿疾病筛查中心或医学遗传中心筛查继而确诊的223例汉族PKU患者，包括新疆71例，陕西55例，青海32例，宁夏35例，甘肃30例。其中，男114例，女109例，年龄范围从2个月至15岁，平均年龄(3.3±0.7)岁。初诊血清Phe浓度为226-2430 μmol/L。确诊标准：对出生72小时后充分哺乳新生儿采集足跟血，对门诊患儿采集静脉血，测定Phe浓度>120 μmol/L者进行召回复查，复查Phe浓度仍然>120 μmol/L，首先确诊为高苯丙氨酸血症(HPA)，再采集患儿血样及尿液标本进行血二氢蝶呤还原酶测定、四氢生物蝶呤(BH4)负荷试验(>600 μmol/L)或者Phe和BH4联合负荷试验(≤600 μmol/L)及尿蝶呤谱分析，排除四氢生物蝶呤缺乏症、一过性高苯丙氨酸血症和酪氨酸血症等。对Phe>600 μmol/L患儿行低苯丙氨酸饮食控制治疗。所有受试者均签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准实施。

1.2 检测方法标本采集及DNA提取：抽取患儿及父母外周静脉血1 ml，滴于滤纸上呈3-5个滤纸斑，阴凉干燥避光处晾干，1-2 h后装入无菌干净密封袋内备用。采用血片快速酚/氯仿抽提法，提取基因组DNA保存于-20℃备用；PCR扩增及序列测定：PAH基因启动子及第1-13外显子的引物序列参照文献[4]，严格按照引物序列设计原则设计完成。PCR扩增参数及具体操作步骤参照文献[5]。采用PCR产物直接测序法，样品纯化及序列分析应用美国ABI 3130 XL型序列分析仪完成。每个测序样品进行两次PCR，分别测定正、反方向的基因序列，所有序列变异位点均针对该位点，检测患者父母的DNA序列，以确定序列变异来源。如有新突变同时对患者双亲进行序列分析。

1.3 突变命名和验证已知突变的命名结合测序结果参照http://pahab.mcgill.ca提供的突变名称命名。新突变的命名参照http://www.hgvs.org /mutnomen提供的命名法来命名。新序列变异通过查阅国际PAH数据库(http://www.biopku.org/pah)、国际人类基因突变数据库专业版Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Pubmed)来确定，所有新变异均通过100名健康无关个体相应外显子测序排除为多态性位点后被认定为新突变。

1.4 统计学分析用SPSS 15.0软件进行数据统计和分析，计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 西北地区汉族PKU患者PAH基因突变分布及特点

西北地区汉族PKU患者PAH基因致病突变检出率为88.6%(395/446)，在446条等位基因中共检测出75种PAH基因致病突变，来自外显子的有66种(88.0%)，来自内含子的有9种；共涉及5种突变形式，其中，错义突变50种(66.7%)、剪切位点突变12种(16.0%)，无义突变7种(9.3%)，移码突变4种(5.3%)，缺失突变2种(2.7%)。本研究中，除了外显子1和外显子13之外，在其他外显子中均检测到外显子突变，还在内含子4、内含子7、内含子8、内含子10、内含子11、内含子12中检测到46个剪切位点突变(10.3%)，其中PAH基因致病突变主要分布在E7(29.0%)、E6(10.5%)、E3(10.3%)、E11(9.6%)、E12(8.5%)、I4(6.7%)和E2(4.5%)。突变频率较高的PAH基因致病突变是R243Q(22.1%)、IVS4-1G>A(6.7%)、EX6-96A>G(6.5%)、R111X(5.4%)、R53H(4.3%)、Y356X(4.0%)、R413P(3.8%)、V399V(3.1%)、IVS7+2T>A(1.8%)，这些常见突变约占基因突变的57.7%，其余突变均为散在发生(<2.0%)。

2.2 西北地区汉族PKU患者PAH基因常见致病突变检出率与其他国家及地区比较

如表1所示，西北汉族PKU患者最常见的PAH基因突变是R243Q，与中国北方基本一致，但明显区别于日本(R413P)、巴西(V388M)及德国(R408W)、立陶宛(R408W)、美国(R408W)。西北汉族PKU患者PAH基因突变构成与中国北方类似，但显著区别于日本、德国、美国、巴西、立陶宛等亚洲及欧美国家。

表1 西北地区汉族PKU患者PAH基因常见致病突变检出率与其它国家及地区的比较

2.3PAH基因新突变发现

经检索国内外文献及PAH数据库，在西北汉族检测出的N93fsX5(c.279_282delCATC)、G171E(c.512G>A)、P225S(c.673C>T)、Q304K(c.910 C>A)、H107R(c.320 A>G)、F392I(c.1174 T>A)和N223I(c.668A>T)是国际上尚未见报道的新的PAH基因突变，并已提交国际PAH突变基因数据库(http://www.biopku.org/pah/)登记。N93fsX5突变(图1)是由于在PAH基因编码区279-282核苷酸之间发生了CATC 4个碱基的缺失，导致第93位氨基酸由天冬酰胺(Asn)突变为赖氨酸(Lys)，同时引发由此往后排列编码的第5位氨基酸的密码子变为终止密码，属于第3外显子上的移码突变；G171E突变(图2)是由于编码区第512位碱基由G变为A，导致第171位氨基酸由甘氨酸(Gly)变为谷氨酸(Glu)，为第6外显子上的错义突变；P225S突变(图3)是由于PAH基因编码区第673位碱基(第6外显子)由C变为T，发生第6外显子上的错义突变，导致第225位氨基酸由脯氨酸(Pro)变为丝氨酸(Ser)；Q304K突变(图4)是由于PAH基因编码区第910位碱基由C变为A，导致第304位氨基酸由谷氨酰胺(Gln)变为赖氨酸(Lys)，为第8外显子上的错义突变；H107R突变(图5)由于PAH基因编码区第320位碱基由A变为G，导致第107位氨基酸由组氨酸(His)变为精氨酸(Arg)，为第3外显子上的错义突变；F392I突变(图6)是由于PAH基因编码区第1174位碱基由T变为A，导致第392位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)变为异亮氨酸(Ile)，为第11外显子上的错义突变；N223I突变(图7)是由于PAH基因编码区第668位碱基由A变为T，导致第223位氨基酸由天冬酰胺(Asn)变为异亮氨酸(Ile)，为第6外显子上的错义突变。

3 讨论

本研究在西北地区汉族PKU患者PAH基因的11个外显子和6个内含子中共发现75种致病突变，在外显子中检出率最高(88.0%)，主要突变形式有5种，但主要以错义突变、剪切位点突变和无义突变为主(占比92.0%)。无论是突变种类数还是突变形式均显著区别于伊朗[12]、意大利[13]、西班牙[14]、巴西[11]、美国[10]等其他亚洲、欧洲和美洲国家。这充分表明PAH基因中任何碱基的突变都可能导致酶活性的降低或缺失，导致PKU发生，表现出突变遗传异质性的复杂多样性[15-16]。研究发现西北地区汉族PAH基因致病突变主要分布在E7(29.0%)、E6(10.5%)、E3(10.3%)、E11(9.6%)、E12(8.5%)、I4(6.7%)和E2(4.5%)，这与欧洲人更多集中在第3、10和12外显子明显不同[9]，提示进行PKU早期筛查和基因诊断时应首先选择这些PAH基因突变热点外显子和内含子区域。西北地区汉族PKU患者中居于首位的PAH基因突变为R243Q(22.1%)，与中国北方[6]、韩国[8]基本一致，但明显区别于日本[7]、巴西[11]最常见突变分别为R413P、V388M，也区别于德国[9]、立陶宛[9]、美国[10]等欧美国家最常见的R408W突变。

图1 PAH基因外显子3 N93fsX5(c.279_282delCATC，p.Asn93LysfsX5)杂合子突变箭头所示为基因突变位置

图2 PAH基因外显子6 G171E(c.512G>A，p.Gly171Glu)杂合子突变箭头所示为基因突变位置

图3 PAH基因外显子6 P225S(c.673C>T，p.Pro225Ser) 杂合子突变箭头所示为基因突变位置

图4 PAH基因外显子8 Q304K(c.910 C>A,p.Gln304Lys)杂合子突变箭头所示为基因突变位置

图5 PAH基因外显子3 H107R(c.320 A>G,p.His107Arg)杂合子突变箭头所示为基因突变位置

图6 PAH基因外显子11 F392I(c.1174 T>A,p.Phe392Ile)杂合子突变箭头所示为基因突变位置

图7 PAH基因外显子6 N223I(c.668A>T,p.Asn223Ile)杂合子突变箭头所示为基因突变位置

此外，本研究发现的常见突变还包括EX6-96A>G(6.7%)、IVS4-1G>A(6.7%)、R111X (5.4%)、R53H(4.2%)和Y356X(4.0%)等突变，PAH基因突变分布构成与中国北方、韩国相似，但显著不同于日本、德国、美国等亚洲及欧美国家，推测R243Q基因突变频率的高发在中国北方地区，而欧洲地区是R408W突变的起源地，这充分证实不同国家、地区及不同民族间PAH基因的突变特点的独特性、差异性和复杂性。

本研究经检索国内外文献及PAH相关数据库(http://www.biopku.org/pah等)，还在西北汉族PKU患者中发现了7种新的PAH基因突变。苯丙氨酸羟化酶通常以具有催化活性的四聚体形式存在，其单体由N端调节区(1-142aa)、催化区(143-410aa)及C端的四聚体区(411-452aa)三部分组成，PAH基因突变对苯丙氨酸羟化酶活性的影响依赖于突变的形式和位置[17]。G171E(青海)、N223I(宁夏)、P225S(新疆)、Q304K(宁夏)、F392I(宁夏)这5种突变均为错义突变，均位于酶单体中α螺旋富集的催化区，由于某一碱基突变导致相应编码氨基酸改变，影响苯丙氨酸羟化酶分子活性位点的形状，进而影响基因转录、翻译以及蛋白质的折叠、聚合，导致酶蛋白的活性功能有所降低。H107R(宁夏)突变位于酶单体的N端调节区，为PAH基因第3外显子上的错义突变，由于编码区第320位碱基由A变为G，导致第107位氨基酸由组氨酸(His)变为精氨酸(Arg)，改变了苯丙氨酸羟化酶的结构并影响了酶活性功能的正常表达。N93fsX5(青海)属于第3外显子上的移码突变，是由于在PAH基因编码区279-282位核苷酸之间发生了4个碱基(CATC) 的缺失，导致由此往后排列编码第5位氨基酸的密码子变为终止密码，使得合成的肽链缩短，从而严重降低了苯丙氨酸酶蛋白的活性发挥。

历史的积淀和民族的交融发展，造就了西北地区复杂的遗传背景，也导致本地区汉族PAH基因的遗传和变异形成了自身的特点，无论是在突变基因种类、突变形式以及突变分布规律上，既包含中国北方其他省区常见的突变类型及规律，也能发现中国北方及南方其他省区尚未报道的新突变，这也从侧面揭示西北汉族历经数千年历史发展，伴随历史、地理及民族融合等诸多因素影响，人口来源多样繁杂，形成其鲜明的地域特征，这对于丰富完善我国汉族PAH基因突变谱提供重要理论依据，为有效降低西北地区PKU发病率，提高出生人口素质具有重要价值。