Toll样受体激动剂在变应性鼻炎免疫治疗中的研究进展

贾惠静，薛金梅

(1.山西医科大学，山西 太原 030001；2.山西医科大学第二医院 耳鼻咽喉头颈外科 山西省气道炎性疾病神经免疫研究省级重点培育实验室，山西 太原 030001)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是机体接触变应原后主要由IgE介导的炎症因子释放、多种免疫细胞共同参与的鼻黏膜非感染的炎症性疾病。同时，AR患者在发作期有不同程度的气道炎症和气道高反应性，增加哮喘发生的风险[1]，已成为一个全球性健康问题，严重影响患者的生活质量。目前学界在阐明变态反应的发生和机制方面取得了显著成果，发现AR与炎性介质、免疫功能失衡有关。天然免疫系统通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，在病原体识别和保护性免疫应答启动中发挥关键作用[2]。而Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)作为天然免疫系统的重要PRRs，是针对细菌和病毒病原体提供保护的第一反应者，对入侵的病原体提供防御性炎症反应，其在鼻黏膜屏障中的作用逐渐得到了广大学者的一致认可。近年来，TLRs激动剂作为治疗靶点治疗变态反应性疾病正处于不同发展阶段，目前研究主要集中在TLRs激动剂2、3、4、7、8、9亚型，本文重点将以上亚型在AR治疗中的研究进行阐述，为临床治疗AR提供新的治疗方向。

1 TLRs结构和功能

TLRs是一种可识别高度保守病原相关分子模式的I型跨膜受体，其基本结构由3部分组成：富含亮氨酸的胞外段、跨膜段、胞内段。富含19 ～ 25个亮氨酸碱基重复序列构成的胞外段的主要作用是识别TLRs相应配体，胞内段主要参与TLRs的信号传递，完成整个信号通路的转导过程[3]。人体内现已发现的TLRs有10种，即TLR1～TLR10，其中TLR1、2、4、5、6 和 10 表达于细胞表面，与其相应的配体相结合；而 TLR3、7、8 和 9 通常位于细胞内，它们的天然配体可能仅存在于细胞内[4]。不同的TLRs与其特定的配体结合介导各种细胞信号的传导。

天然免疫系统是机体抗感染过程中的第一道防线，TLRs作为最早一类被发现的PRRs，在天然免疫和获得性免疫反应中都发挥重要作用。TLRs激活后通过识别不同PAMPs促使树突状细胞( dendritic cells，DCs)成熟，活化T细胞、B细胞启动获得性免疫，是介导免疫应答和免疫耐受的关键分子；TLRs 还可以诱导机体抗微生物防御系统，产生各种趋化因子和炎性介质，调节机体辅助性T细胞( T helper cell，Th) 1 和 Th2 的平衡[5]。TLRs激动剂可作为免疫治疗的靶点，通过诱导免疫耐受或气道免疫反应向Th1分化阻止变应性气道疾病进展。

2 TLRs激动剂在AR治疗中的作用

2.1 细胞外TLRs激动剂

2.1.1 TLR2激动剂 TLR2 位于细胞膜上，主要识别细菌、真菌等结构序列，可与TLR1或TLR6形成异二聚体识别不同的配体。当TLR2/TLR1形成异二聚体时，该复合物可对来自革兰氏阳性细菌和支原体的三酰化脂肽产生反应；而当形成TLR2/TLR6异二聚体时，它反而识别来自革兰氏阴性细菌和支原体的二酰化脂肽[6]，形成不同异二聚体可以识别不同的配体，激活不同的信号反应。

有研究发现，雾化吸入TLR2/1激动剂Pam3Cys使卵清蛋白致敏小鼠先出现短暂性的哮喘，但随后其气道高反应会减轻或消失，嗜酸性粒细胞显著减少[7]。Pam3Cys，是一种生物合成的三酰化脂蛋白，可作为抗过敏剂或免疫佐剂。Pam3Cys 还可以增加肿瘤表面标志物 CD80和 CD86 的表达，促进DCs的激活，进而增加气道黏膜中干扰素-γ的产生[8]，而干扰素-γ能有效抑制 Th2 反应，抑制嗜酸性粒细胞的活化、分化和募集，从而减轻气道变应性炎症。另一种TLR2/1激动剂Pam3CSK4可降低鼻呼气中一氧化氮(nNO)水平，可以抑制 CD4+T细胞增殖和 Th2 细胞因子的产生[9-10]，经鼻给药后可以明显改善鼻部过敏症状。从以上体外模型和小鼠体内模型研究说明TLR2/1激动剂有成为免疫佐剂治疗AR的潜力。TLR2/6激动剂—巨噬细胞活化脂肽-2，在哮喘小鼠模型中，经雾化后可使气道高反应、嗜酸性粒细胞和Th2细胞因子显著降低，从而改善鼻过敏症状[11]。巨噬细胞活化脂肽-2还可诱导B细胞和DCs中 CD80、CD86、CD40 以及主要组织相容性复合体I和II的表达，也可增加DCs释放干扰素-γ的能力[12]。

目前用于治疗癌症的OK-432，作为一种TLR2激动剂，有望成为治疗AR和哮喘的可行药物[13]。在过去的研究中，TLR2在呼吸系统的研究仅限于体外和小鼠体内模型，TLR2的激动剂可以有效地抑制Th2反应，减轻过敏症状，在未来的工作中需进一步深入探讨和研发，用于临床治疗AR。

2.1.2 TLR4激动剂 TLR4是第一个通过遗传学方法鉴别出来的TLR，表达于细胞膜上，主要是形成同源二聚体发挥识别配体的作用，其主要配体是细菌脂多糖(bacterial lipopolysaccharide，LPS)。TLR4与LPS结合后导致细胞内接头激活，进一步启动信号转导级联反应[14]。有研究分析LPS在人类DCs中作用时发现，LPS可促进白介素-12p70的产生，提供向Th1分化的刺激[15]。在桦树花粉过敏的体外模型中，使用白桦花粉和LPS联合刺激人脐血细胞，发现Th2反应下调，白介素-13生成减少[16]。Rodriguez等[17]证明LPS还可通过NO合成酶活性抑制Th2介导的变态反应，这表明LPS在抗过敏中发挥重要作用。在季节性AR患者中，可以看到鼻腔灌洗细胞中TLR4表达升高，当使用变应原和LPS同时刺激鼻腔时，可观察到鼻腔中Th1和Th2细胞因子的都增加，而在变应原刺激之前先使用LPS，则没有观察到这一现象[18]，变应原和LPS刺激的时间顺序似乎是一个重要因素，表明LSP刺激可能减轻Th2反应。

TLR4激动剂单磷酰脂质 A，是LPS经水解和色谱分析法后得到的，保留了LPS的免疫调节特性，是LPS的无毒衍生物[19]，是美国食品药品管理局唯一批准用于特异性免疫治疗的第二代佐剂[20]，是第一个用于疫苗佐剂的TLR激动剂[21]。以单磷酰脂质A为佐剂研发的疫苗已用于过敏患者的临床治疗，但因其工业上生产步骤复杂、成本高及质量控制难[22-23]，可能是目前还未应用于临床治疗AR的重要原因。单磷酰脂质A激活TRIF信号通路，诱导核因子κB、细胞因子产生和抗原特异性T细胞活化直接激活抗原提成细胞(antigen-presenting cells，APC)[24-25]。有研究发现，单磷酰脂质 A刺激TLR4后，可促使DCs成熟并产生细胞因子，尤其是白介素-12，进而促使T细胞向Th1分化[26]；在一项体外研究，将单磷酰脂质A与花粉变应原结合刺激APC，结果发现白介素-5的表达下调而干扰素-γ的产生增多[27]，这种抑制Th2因子释放的作用，不仅在于白介素-12分泌增加，还依赖于APC的激活。在AR小鼠模型中，在卵清蛋白致敏期间加入单磷酰脂质A，可导致IgG抗体表达上调，并诱导Th1反应；而不加入单磷酰脂质A时，仅会引起IgE表达增加[28]。CRX-675是一种水性单磷酰脂质A化合物，目前已被用作是抗过敏治疗的独立鼻内制剂，其小剂量鼻内用药即可改善鼻部症状，有数据分析发现CRX-675能降低小鼠哮喘模型中血清总IgE 水平、气道高反应、气道嗜酸性粒细胞和 IL-13[20]。

另外，最近一项新的研究利用TLR4激动剂吡喃葡萄糖基脂质A，作为诱导AR小鼠模型中佐剂，可以抑制嗜酸性粒细胞增多及白介素-5的分泌[29]，但具体机制并未阐明，在未来的研究中需进一步探索。以上研究结果发现TLR4激动剂可以抑制Th2反应，诱导Th1分化，进而改善过敏症状。

2.2 细胞内TLRs激动剂

2.2.1 TLR3激动剂 TLR3广泛表达于除浆细胞样树突状细胞(pDC)和中性粒细胞之外的其他先天免疫细胞，并在内质网(endoplasmic reticulum，ER)合成后通过跨膜蛋白转运到细胞内体中[30]。TLR3与TIR结构域接头蛋白直接相互作用，可激活核因子κB信号通路和促炎细胞因子的生成，并且嗜酸性粒细胞可能通过TLR3激活加重AR炎症反应[31]。一项研究发现，AR患者间充质干细胞表达的TLR3量较其他TLRs多[32]，间充质干细胞在调节人体内免疫反应中发挥关键作用，AR患者间充质干细胞TLR3表达增加，表明其可能参与AR的发生；并且dsRNA/TLR3相互作用与胸腺基质淋巴生成素的产生和激活密切相关[33]，胸腺基质淋巴生成素是启动Th2炎症的报警因子，在变应性炎症反应中起着关键作用,靶向胸腺基质淋巴生成素的生物制剂可用于变应性气道疾病的治疗[34]。TLR3可识别病毒的dsRNA、人工合成的dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞苷酸和宿主的mRNA[35]。Fransson等[36]研究发现AR患者鼻黏膜中TLR3 mRNA和蛋白表达水平上调，但白介素-4和白介素-5存在时可使TLR3的表达下调，结果证实在花粉季节和Th2细胞因子环境的存在下，TLR3表达水平会下降[31]，这可能与Th2细胞因子启动的自动调节反馈回路有关。

有学者使用聚肌苷酸-聚胞苷酸刺激卵清蛋白致敏的小鼠模型，结果发现AR小鼠的过敏症状并没有减轻，表明聚肌苷酸-聚胞苷酸可能通过产生IgE增强变态反应[8,37]。聚腺苷酸：聚尿苷酸，是一种毒性较低的聚肌苷酸-聚胞苷酸，其可在体外或体内通过激活嗜碱粒细胞加重了卵清蛋白诱导的变应性哮喘[38]，聚腺苷酸：聚尿苷酸可诱导DCs分泌白介素-12p40[39]，白介素-12p40可与促进Th1反应的白介素-12p70竞争，有利于促进Th2炎症。以上研究结果表明，TLR3激活或表达增加，可促进变应性炎症反应，可能是AR发病的危险因素，因此后期可进一步探讨TLR3拮抗剂的作用，可能成为治疗AR的免疫治疗方法。

2.2.2 TLR7/TLR8激动剂 TLR7、TLR8位于细胞膜内，有研究发现单链RNA能够同时激活TLR7和TLR8[40]，比如疱疹病毒、免疫缺陷病毒等。TLR7和TLR8在结构上有高度序列同源性，并且功能也相当接近的胞内免疫受体，TLR7/8受体与配体相互作用可导致MyD88信号通路激活，可促进Th1型细胞因子产生，抑制Th2反应，从而改善过敏症状[41]。 TLR7/TLR8激动剂作为研发疫苗佐剂具有炎症调节、抗病毒和抗肿瘤等性能[42]，其在新型冠状病毒疫苗的研发中也发挥了积极的佐剂作用[43]。近年来一项针对季节性AR患者的临床研究中发现，使用TLR7 激动剂 AZD8848喷鼻治疗后，AR患者的过敏症状可以得到有效缓解，并且血清中Th1型细胞因子表达上调[44]、通过鼻内用药可有效降低肥大细胞类胰蛋白酶和α2-巨球蛋白的表达，肥大细胞的活性降低[45]，表明TLR7激动剂对AR有显著的疗效。瑞喹莫德(R848)是小分子三环有机化合物，是一种TLR7/TLR8受体激动剂。在胸腺基质淋巴生成素刺激的人DCs的体外模型中，R848能有效抑制Th2介导的反应[46]；Boghdadi 等[47]也发现，使用R848刺激AR患者的外周血单核细胞，其抗炎介质 白介素-4、白介素-10、白介素-13、干扰素-γ表达显著增加，这些研究结果提示了R848 既可以介导抗炎效应，还可抑制Th2反应，改善过敏症状。在卵清蛋白诱导的AR小鼠模型中，R848诱导TLR7激活后可上调白介素-12和干扰素-γ水平，降低Th2细胞因子表达水平，同时减少嗜酸性粒细胞的浸润和杯状细胞的增生，增加Th1和Treg细胞的比例[48-49]，有效改善AR小鼠鼻部症状。R848在治疗气道炎症性疾病方面也是具有前景的免疫佐剂。比如，rBet v1疫苗、Der f1疫苗分别是针对桦树花粉和螨虫过敏引发的哮喘的疫苗，rBet v1疫苗联合 R848 的皮下免疫可刺激特异性 Th1 反应，有效抑制了桦树花粉诱导的哮喘[50]；Der f1 疫苗联合 R848可以显著控制变应性哮喘的症状[51]。

VTX-1463是一种TLR8激动剂，作为目前用于AR的临床治疗药物，可诱导TLR8信号通路，激活APC细胞因子的应答，从而诱导Th1应答，旨在转变Th1/Th2平衡率，从而降低变态反应[52]，AR患者对其耐受性良好，目前未见相关不良反应的报道。从以上研究可以看到，TLR7/TLR8激动剂成为AR的治疗性药物或佐剂具有很大的潜力。

2.2.3 TLR9激动剂 TLR9位于细胞膜内，可识别细菌和病毒基因组中存在但在哺乳动物细胞中很少见到的未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸基序，介导机体的免疫反应。胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸 寡核苷酸作为一种变态反应抑制剂，可以有效地抑制Th2细胞因子释放，降低气道嗜酸粒细胞、IgE水平，防止气管重构[53]，改善AR鼻黏膜的病理炎症。胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸是一种合成的TLR9激动剂，可刺激B细胞、NK细胞和特异性APC增殖，并分泌多种细胞因子、趋化因子和免疫球蛋白[54]。在AR小鼠模型中，在卵清蛋白致敏期间使用胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸，可通过减少白介素-4、白介素-5、白介素-13、IgE嗜酸性炎症和促进干扰素-γ的增多，抑制Th2反应[55]；另有研究发现，胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸可降低小鼠哮喘模型支气管肺泡中嗜酸性粒细胞、白介素-4、白介素-5和IgE的产生，并提高白介素-10水平[56]。噬菌体Qbeta衍生的病毒样颗粒QbG10，属于A型 胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸，也是一种TLR9激动剂，目前已被包装成CYT003-QbG10的病毒样纳米颗粒制剂，在IIb期临床研究中用于治疗屋尘螨致敏的AR患者，对该制剂表现出良好的耐受性，可有效降低AR患者的症状评分，提高患者的生存质量[57]；另外，持续性过敏性患者在停用类固醇药物后，皮下注射QbG10也可使过敏症状得到良好的控制[58]，这项研究提示，QbG10可能成为未来治疗变应性疾病的新治疗方向。

一种新型TLR9激动剂AZD1419，具有较强的药理活性，能诱导干扰素信号传导，这可能直接导致 Th2 反应的失调并影响气道炎症进展，在动物模型中诱导对气道变态反应的持久抑制，在临床试验中安全且耐受性良好[59]，可有望用于临床上治疗AR。变应原原-TLR9免疫刺激DNA序列结合物，在季节性花粉暴露时，使用DNA序列结合物短期治疗可减轻Th2反应，但在后续的临床试验中，DNA序列结合物的治疗效果并不理想[60]，因此DNA序列结合物的起效时间和作用还存在较大争议。以上研究表明，部分TLR9激动剂在治疗AR的作用存在分歧，需要更深入的研究和探讨，用于临床治疗需要更多的数据验证。

3 总结与展望

TLRs在气道炎症中发挥重要作用，TLRs激动剂作为治疗变应性疾病的新颖靶点，具有抗原性的TLRs激动剂可作为免疫疫苗的佐剂，而有些TLRs激动剂则可直接用于治疗AR。TLRs激动剂是一个不断发展的领域，作为免疫调节剂，具有很强的治疗潜力。尽管TLRs作为靶点在治疗AR有良好的应用前景，但仍有很多问题需要解决。目前大多数TLRs激动剂的研究限于体外或小鼠体内，需要完成大量临床研究，观察其疗效；部分临床试验因缺乏对给药时间、剂量等的研究，可能会导致过度免疫反应。因此，这就需要我们进一步深入研究TLRs激动剂在AR 中的作用，为临床治疗 AR 探索新的途径。