生物力学与椎间盘退变的相关性研究进展

刘明强，张广智，陈海伟，康学文

(1.兰州大学临床医学院,甘肃兰州 730030;2.甘肃省骨关节疾病研究重点实验室, 甘肃兰州 730030；3.兰州大学第一医院，甘肃兰州 730001)

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration, IVDD)是脊柱退行性疾病的病理基础，是由多种因素(非生理性压力载荷、炎症反应、营养供应障碍和遗传)引起的一种慢性复杂的病理状态。在日常活动中，椎间盘(intervertebral disc, IVD)受到各种类型[拉伸力、压力、流体剪切力(fluid shear stress,FSS)]、作用强度及作用时间的压力载荷，不同的压力载荷对IVD组织有不同的影响。生理条件下，IVD承受轴向压力载荷并将压应力扩散，软骨终板(cartilage endplate, CEP)缓冲压应力并使其均匀分布至髓核(nucleus pulposus, NP)，NP受到压缩应力后，通过其形变能力各向分散到纤维环(annulus fibrosus, AF)，AF通过拉伸力控制NP形变，以此发挥IVD对压力载荷的吸收和传递作用，不仅满足了脊柱活动对IVD的力学要求，而且有助于改善IVD的微环境，提高NP细胞的活性[1]。Wang等[2]研究表明，循环机械拉力(cyclic mechanical tension,CMT)可以减轻NP细胞的退变。然而，异常力学载荷与IVDD同样具有明显相关性，脊柱的各种急慢性机械损伤产生强烈的应力作用于具有减震功能的IVD，使得IVD细胞暴露于异常压力载荷下，NP细胞发生衰老、凋亡和坏死，使其活性降低、数目减少，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)由合成代谢向分解代谢转变，这些改变均是IVDD的主要病理过程[3-5]；另外，临床证据也表明，有下腰痛的体力劳动者的脊柱压力载荷明显高于无症状者[6]。然而，力学载荷对IVD细胞，尤其是NP细胞影响的具体机制仍不清楚。为此，本文主要总结异常力学载荷对IVD细胞，尤其是NP细胞的影响及其作用机制，以期为延缓甚至逆转IVDD提供新的方向。

1 压力载荷与IVD营养代谢障碍

IVD细胞营养供应和乳酸等代谢副产物的清除，主要是通过CEP渗透途径及外层AF周围的血管途径，研究表明，IVD依靠间断性压力载荷使渗透压发生变化，为生长因子等营养物质的传输提供“泵送”效应[7]。然而，异常压力载荷可加速CEP发生钙化、血管退化萎缩，导致渗透系数及转运速率明显下降，使得IVD细胞尤其是NP细胞及内层AF细胞代谢所需的糖、氧气，以及其他大分子营养物质和乳酸等代谢产物的扩散或排出途径受阻。NP细胞在酸性低氧微环境下细胞活性降低、功能细胞数目减少，ECM合成代谢能力减弱，最终促进IVDD的进展[8,9]。

2 压力载荷与ECM重塑

在生理条件下，NP细胞可以合成和分泌蛋白聚糖及Ⅱ型胶原分子来维持ECM的平衡及NP组织的含水量以保持IVD组织的正常结构和力学特性；因此，ECM的代谢平衡对延缓IVDD的发生至关重要。ECM的降解过程受基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、基质金属蛋白酶抑制剂及解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintegrins and metalloproteinases with thrombospondin motifs,ADAMTS)的调控，MMPs、ADAMTS是介导ECM退变的主要蛋白水解酶，当前参与退变的亚型主要是MMP3、MMP13和ADAMTS4、ADAMTS5[10, 11]。ECM合成与分解代谢的平衡与压力载荷有密切关系，不同类型及载荷强度的压力载荷可以通过调节MMPs、ADAMTS基因的表达影响ECM的稳态。异常力学载荷使MMPs、ADAMTS基因表达增加，ECM分解代谢超过合成代谢，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖含量明显下降，导致NP组织脱水和纤维化，椎间隙高度下降，IVD结构失稳，加速IVDD发生进程[12]。

3 压力载荷对NP细胞活性的影响

3.1 调节细胞自噬反应

自噬是一种高度保守的溶酶体降解途径，通过选择性地清除错误折叠的蛋白质和受损的细胞器，维持细胞内环境的稳态。生理条件下，细胞的自噬反应处于基础水平；但在外界不利条件刺激下，自噬反应明显增强[13]。研究表明，自噬功能障碍与骨关节炎、神经退行性病变、IVDD等疾病有关[14-16]。适当水平的自噬反应可提供足够的代谢底物和能量，进而促进压力载荷作用下NP细胞损伤成分的降解，这可能是一种重要的生存反应；而过度的自噬反应，可能会引发自噬性细胞死亡。

压力载荷可以激活NP细胞自噬反应。Ma等[17]研究不同时间静态压力载荷对NP细胞自噬反应的影响，通过对1 MPa的静态压力载荷作用下大鼠NP细胞自噬小体及自噬相关蛋白及细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的检测发现：在36 h之内，自噬小体、自噬流、自噬相关蛋白的表达及ROS的生成随压力载荷作用时间延长而增加，但用ROS清除剂预处理之后，NP细胞自噬能力反而下降；然而，使用自噬抑制剂之后，在压力载荷刺激36 h内，NP细胞活性明显下降，当延长压力载荷作用时间至48 h以上，细胞活性较未使用自噬抑制剂组升高；上述结果提示，适当作用时间的静态压力载荷可增加ROS的生成、参与激活自噬反应，从而发挥对细胞的保护作用，然而过长时间的压力载荷可引起自噬性细胞死亡，减少功能性细胞数量，降低细胞活性。Li等[3]建立静态压力载荷模型发现，1 MPa的载荷强度持续刺激48 h之内，可以通过激活Ras/MEK/ERK/NRF1/Atg7信号通路来激活细胞自噬反应，减轻压力载荷诱导的细胞凋亡，从而提高异常压力载荷下细胞的活性。Chen等[18]研究不同强度FSS对大鼠NP细胞自噬反应的影响，发现适当的FSS处理组(12 dyne/cm2,2 h)与空白对照组相比：血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、自噬小体及自噬相关蛋白明显增加，说明适当强度的FSS可以通过上调HO-1来激活细胞自噬反应，从而发挥对细胞的保护作用；然而，载荷过度的FSS(24 dyne/cm2,2 h)可以促进自噬性细胞死亡。上述研究结果均提示，NP细胞自噬反应的适当激活有利于减轻压力载荷对细胞的损伤，增加细胞的活性，延缓IVDD的进程；而当压力载荷过强或作用时间过久可引起自噬性细胞死亡，明显降低NP细胞活性，加速IVDD的进展。

3.2 压力载荷与细胞凋亡和坏死

细胞凋亡是受高度调控的细胞死亡形式，主要特征是凋亡小体形成、DNA断裂、染色质浓缩、核碎裂及凋亡蛋白酶的激活。压力载荷诱导NP细胞的凋亡减少了功能性细胞的数量，是IVDD中最重要的病理过程之一[19]。Huang等[20]研究人NP间充质干细胞在1.0 MPa的静态载荷持续作用下凋亡相关蛋白的表达及凋亡率的变化，发现NP细胞凋亡蛋白的表达随压力载荷作用时间的延长而增加。Zhao等[21]通过建立体外IVD受力刺激模型，观察静态压力载荷对NP细胞凋亡的影响，同样发现细胞凋亡随压力载荷作用时间的延长而增加，通过WB检测说明，细胞凋亡的发生与压力载荷激活Wnt/β-catenin信号通路有关。Zhang等[22]研究不同动态压力载荷对人NP细胞凋亡反应的影响，发现压力过载荷组(0.8 MPa 0.5 Hz作用20 h之后，0.1 MPa 0.5 Hz作用4 h)与其它两组[压力载荷组(0.8 MPa 0.5 Hz作用4 h之后，0.1 MPa 0.5 Hz作用20 h)、空白对照组]相比：凋亡率及凋亡相关蛋白的表达明显上升，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，表明压力过载荷促进NP细胞凋亡；细胞活性在压力过载荷组下降，在压力载荷组增加。上述研究提示，异常作用强度及作用时间的压力载荷促进细胞凋亡反应，降低细胞活性，而适当强度的压力载荷有助于提高细胞活性。

既往研究认为，细胞坏死是由急性损伤导致的被动、非生理性和不可调节的细胞死亡形式；但最新研究发现，坏死是在基因控制下受到高度调节的一种死亡形式，坏死性凋亡是依赖受体相关蛋白激酶(receptor-interacing protein kinase,RIPK)的一种坏死类型。Chen等[23]对大鼠NP细胞施加1.0 MPa的静态压力载荷24 h或36 h后，可发现NP细胞线粒体超微结构的破坏及线粒体和细胞内ROS的含量增加，RIPK的表达增加，提示NP细胞发生坏死性凋亡，且与压力载荷作用时间成正比；抑制RIPK的表达之后，上述改变可减轻，提示压力载荷可通过增加RIPK的表达诱导线粒体功能障碍和氧化压力途径，促进大鼠NP细胞的坏死性凋亡。Chen等[24]将大鼠NP细胞暴露于1 MPa压力载荷下12 h～48 h，通过观察细胞形态、检测凋亡率、RIPK的变化，发现随压力载荷作用时间延长，细胞发生皱缩，凋亡蛋白及RIPK表达明显增加；其结果同样提示，RIPK、混合谱系激酶类结构域轴调节的坏死性凋亡在压力载荷诱导的大鼠NP细胞死亡中发挥重要作用。

总体而言，由压力载荷诱导NP细胞的死亡具有压力载荷类型、作用时间的依赖性，非生理性压力载荷通过调节NP细胞的相关分子和信号通路的表达来调控其坏死和凋亡，最终加速IVDD的发生。然而，非生理性压力载荷诱导IVD细胞死亡的具体机制仍有待进一步研究。

3.3 压力载荷与细胞衰老

NP细胞的衰老被认为是IVDD的一个新标志。NP细胞的衰老可引起促炎因子、ECM分解代谢酶及趋化因子的分泌增多，促进ECM的退变，诱导IVD微环境中炎症因子风暴，最终加速IVDD的进程[25]。相关研究表明，非生理性压力载荷可以加速IVD组织中NP细胞的衰老反应，并启动IVDD的发生[26]。

Wang等[27]将人NP细胞收集并培养在体外压力模型装置中，通过设立空白对照组和高强度压力载荷组发现，高强度压力载荷组细胞内ROS的产生明显增加，线粒体膜电位减少，与线粒体自噬相关蛋白PINK1的表达减少，SA-β-gal染色呈阳性的细胞数量显著增多，衰老相关蛋白p53、p21和p16的表达增多，提示过高的压力载荷可通过抑制线粒体功能和线粒体自噬反应、促进氧化应激途径来诱导NP细胞发生衰老。Feng等[28]研究不同强度及作用时间的CMT对大鼠NP细胞衰老的影响，分为拉伸长度5%及20%组，发现拉伸长度5%时，作用48 h才能增加细胞衰老相关蛋白的表达，而拉伸20%则显著增加细胞的衰老且具有时间依懒性；通过细胞免疫荧光、qRT-PCR和WB检测发现，20%CMT可通过增加DNA损伤、激活p53-p21-Rb信号通路诱导大鼠NP细胞衰老反应，加速IVDD的进程。上述研究均说明，作用于IVD组织的非生理性压力载荷可通过多种途径诱导NP细胞的衰老反应，促进IVDD的发生发展。

4 小结与展望

IVDD是一种多因素介导的脊柱退行性疾病，IVD细胞尤其是NP细胞发生衰老、凋亡、坏死及ECM代谢异常，是IVDD的重要特征。研究表明，非生理性压力载荷是导致IVDD发生发展的重要因素。然而，异常压力载荷诱导IVDD的具体病理机制仍不十分明确，许多研究均停留在细胞水平或动物模型上，且多为大鼠和兔的IVDD模型，无法完全模拟人体IVD内生物力学特性及其具体变化；并且，当前异常力学载荷在IVDD中的研究主要集中在NP细胞中，AF及CEP作为IVD中的重要组成部分，与IVDD的发生发展息息相关，但异常力学载荷与AF和CEP的研究仍然十分匮乏。虽然有相关研究表明，适当压力载荷可以提高NP细胞活性，延缓IVDD的进展，但同样无法模拟人体IVD所对应的生理性压力载荷。因此，对NP细胞受到异常力学载荷后，引起生物活性降低、最终导致IVDD的机制研究，异常力学载荷对AF及CEP的研究，及如何设计构建符合人体生物力学特性的IVDD模型，可能是一个重要的方向。笔者相信，今后对生物力学与IVD组织稳态之间的研究将为延缓或逆转IVDD的发生提供新的理念。