LRRK2的功能及其在神经变性疾病中的作用机制

张秋阳，蒋小玲，程云帆，潘晓东

富亮氨酸重复序列激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)基因位于染色体12p11.2-q13.1，其所编码的LRRK2蛋白，属于ROCO超家族，是由2 527个氨基酸组成的大分子蛋白。最新发现LRRK2可以作为神经囊泡运输、免疫及炎症的主要调节剂，其突变在引起帕金森病(Parkinson's disease，PD)、路易体痴呆、麻风病、克罗恩病等中枢和外周免疫相关疾病中具有重要作用[1]。迄今为止，在PD研究领域，LRRK2基因仍是研究的热点。除PD外，近年来的遗传学研究表明，LRRK2突变与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的病理改变及发生风险密切相关，本文将对此展开综述。

1 LRRK2的结构及介导的信号通路

LRRK2基因也称为Park8 基因，是一种大小为280 KDa的多区域多功能、广泛表达的大分子蛋白[1]。其复杂的结构域和广泛的表达，预示着其复杂的细胞功能和活动。LRRK2通过ROC-COR结构域赋予GTPase活性和丝氨酸-苏氨酸激酶两种不同酶活性的结构域，嵌入ARM、ANK、LRR及WD40 4个蛋白相互作用的结构域中[1]。在LRRK2的两种酶活性中，大部分功能都集中在激酶活性上。最常见的致病变异体G2019S突变会导致其激酶活性升高[2]。由此猜想，所有致病突变可能通过底物蛋白的过度磷酸化而导致疾病的病理状态。此机制促进了开发LRRK2激酶抑制剂的可能性。

LRRK2介导的信号通路包括生长因子、存活、死亡受体和Wnt信号通路[3-4]。到目前为止，LRRK2的上游调控是通过结构性活性激酶GSK3β和CK1α的异磷酸化进行的。这些激酶以及PKA会磷酸化ANK和LRR重复序列之间的残基，而磷酸酶PP1会介导磷酸化位点的去磷酸化，从而影响与14-3-3蛋白的相互作用。反过来，这种异磷酸化是与14-3-3蛋白相互作用所必需的，对LRRK2的亚细胞定位具有重要意义[5]。有研究发现Rab蛋白是最成熟的LRRK2激酶底物。Rab29已被确定为LRRK2的上游GTPase，它将GTP结合的LRRK2招募到反式高尔基体中，从而增强LRRK2 S1292的自动磷酸化，并可能增加LRRK2的异磷酸化，同时刺激高尔基体衍生的囊泡清除[6]。这表明LRRK2在Rab蛋白的下游和上游，特别是Rab29的下游和Rab8a、Rab10及Rab29的上游分别存在一个信号环。根据LRRK2作为信号支架的角色，这种在反式高尔基体的复杂相互作用很可能发生在多蛋白信号转导复合物中。

2 LRRK2的定位与表达

LRRK2主要存在于细胞质中[7]。LRRK2富含于脂筏、早期内小体、溶酶体、突触小泡及质膜，也存在于高尔基复合体、内质网和线粒体外膜[8]。此外，LRRK2也与内化的表皮生长因子存在共定位，表明相当一部分蛋白质存在于内体系统膜上。LRRK2在几种膜结构中的丰富表达，提示了LRRK2在膜转运中的作用。同时LRRK2还与网格蛋白轻链(CLC)存在部分共定位，这可能反映了LRRK2在蛋白质降解过程中参与多泡小体形成的早期内体(EEA1)的双层网格蛋白涂层[9]。因此，CLC可能作为一种支架将LRRK2募集到早期内体的双层网格蛋白涂层上。有研究提示，在高表达LRRK2的不同细胞类型中经氯喹处理后，LRRK2被募集到扩大的溶酶体上并激活，其上游接头Rab29促进LRRK2在溶酶体上的募集[10]。LRRK2与几种细胞骨架、转运相关蛋白及RabGTPase家族的相互作用进一步支持了LRRK2在蛋白降解途径中的作用[11-12]。

LRRK2在中枢神经系统中也有表达。小胶质细胞是大脑的常驻免疫细胞，关于LRRK2是否在小胶质细胞中表达目前报道并不一致。通过人类和小鼠纯化的脑细胞分类群体的转录分析表明，在星形胶质细胞和神经元中可以检测到LRRK2转录本，而在小胶质细胞中的检测率明显减少[13]。然而，有研究发现，在人类的小胶质细胞、成年小鼠以及来自幼鼠的原代小胶质细胞检测到大量的LRRK2 mRNA和蛋白表达[14-16]。造成上述结果差异的机制尚不明确，很可能是由于在固定的脑组织中使用LRRK2抗体的特异性和重复性问题，另一种可能是难以准确分离小胶质细胞从而导致研究结论产生差异。

3 LRRK2的生理功能

LRRK2涉及细胞系统的多个功能，如细胞迁移、自噬、吞噬作用及炎性细胞因子产生调控[17-18]。在小鼠原代小胶质细胞中，R1441G突变导致脂多糖(LPS)驱动的炎性细胞因子释放增加[15]，而敲除LRRK2基因的表达具有相反的作用[19]。最近有研究发现，LRRK2G2019S突变的中老年小鼠的皮层、纹状体脑区中的炎性细胞因子及其补体的表达水平较高[20]，表明LRRK2基因突变在中枢免疫细胞具有病理作用。

LRRK2也与细胞自噬有关。自噬的降解途径在调节先天免疫系统和获得性免疫系统的不同方面起着至关重要的作用，并且由于这两条途径在溶酶体上的汇聚而与吞噬作用有内在的联系。有研究表明，LPS刺激单核细胞系增加了LRRK2向自噬体膜的募集，LRRK2基因的敲除导致自噬缺陷[21]。此外，在小鼠巨噬细胞系中发现，当溶酶体超负荷应激时，LRRK2与RAB7L1一起被招募到溶酶体，在溶酶体中，LRRK2通过磷酸化使Rab8和Rab10特异性地稳定在过载的溶酶体上[10]。同一研究发现，LRRK2基因敲除增加了空泡化和脂褐素的自发荧光，表明LRRK2可能在溶酶体应激时，防止溶酶体扩大和上调溶酶体的分泌。

4 LRRK2突变与PD

LRRK2基因的显性遗传突变可能是家族性和散发性PD最常见的原因，已在大约3%～5%的家族性和1%～3%的散发性PD病例中发现，不同人群的发病率可能有很大差异。目前的研究发现G2019S和R1441C是最常见的两种突变，在某些人群中占遗传性PD病例的30%，在散发型PD病例中分别占10%和2.5%[22]。LRRK2的病理功能主要与异常的激酶活性有关。一般来说，LRRK2致病突变体的高激酶活性与PD的一系列神经病理特征相关，包括α突触核蛋白异常沉积、磷酸化Tau蛋白的积累、TDP-43的聚集、多巴胺能神经元死亡、多巴胺神经递质传递和活性受损、炎症反应及氧化损伤等[23]。最近有研究对台湾人群的LRRK2基因测序发现，LRRK2G2385R变异在PD患者中的发生率是正常人的两倍，证实LRRK2G2385R突变是亚洲人群的风险因素[24]。该突变位于WD40的C末端区域，可能改变蛋白质结构并调节LRRK2与囊泡运输相关的相互作用因子的结合。有趣的是，LRRK2R1398H已被确定可通过降低蛋白活性来预防PD[25]。罕见的LRRK2编码变异与较早的疾病发病年龄有关[26]。总之，这些发现表明，LRRK2基因的编码和非编码变异与PD发生有很强的联系，其可影响发病年龄及外显率，并导致PD发病的易感性和保护性。

5 LRRK2突变与AD

尽管LRRK2突变并不常见于AD，但研究显示LRRK2突变与AD病理改变明显关联[27]。Tau蛋白过度磷酸化是AD患者的普遍病理特征。磷酸化形式的Tau从微管蛋白解离并自聚集形成神经内缠结，这与神经元毒性和AD病理有关[23]。先前的研究表明，致病突变体LRRK2G2019S和I2020T可直接在Thr181位点磷酸化Tau蛋白，引起Tau蛋白过度磷酸化[28]。引起Tau 蛋白过度磷酸化的有 GSK3β、MAPKs及CDK5 蛋白激酶，抑制 Tau 磷酸化的有 PP2A及PP2B等去磷酸化酶。LRRK2可以通过磷酸化激活GSK3β，调节p38MAPK使 Tau 过度磷酸化[29-30]。另一方面，淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)在AD发病机制中具有重要作用。有研究表明，AD患者的大脑中存在APP的磷酸化，其与淀粉样蛋白沉积的产生相关。有证据表明APP胞内结构域(APP intracellular domain，AICD)在APP相关疾病(如AD)中可能产生作用。APP Thr668位点的磷酸化可促进AICD的产生和转录活性。LRRK2与APP在其胞内结构域的Thr668位点相互作用并磷酸化。有研究发现，LRRK2G2019S突变致患者死后脑组织和多巴胺能神经元中Thr668处磷酸化APP的数量明显高于健康人。而LRRK2抑制剂可降低患者来源的多巴胺能神经元和LRRK2G2019S小鼠中脑Thr668位点APP的磷酸化。由此可见，APP是LRRK2的底物，LRRK2可能通过影响APP磷酸化和AICD功能参与AD的发病机制[31]。

此外，LRRK2某些基因位点突变也与AD发生风险关联。亚洲人群最常见的LRRK2R1628P突变可减轻AD发生风险[32]，R1628P突变可导致LRRK2激酶功能减低，提示LRRK2缺失可能在AD中具有保护作用。最近，有研究对75个中国AD家庭非携带性痴呆基因致病突变的先证者进行了277个神经退行性相关基因的靶向测序，发现LRRK2I2012T突变在早发性阿尔茨海默病(early onset Alzheimer’s disease，EOAD)家庭中被发现[33]。这些发现提供了LRRK2基因变异可能与AD易感性有关的证据。

6 LRRK2的临床意义

LRRK2是一种大而复杂的蛋白，在疾病的病理生理过程中起着重要作用，其GTPase和激酶结构域的突变与疾病的发生发展密切相关。LRRK2突变及功能异常促进α突触核蛋白异常沉积、Tau病理、炎性反应、突触功能障碍及自噬溶酶体机能异常[20，34-35]，这些病理生理改变在AD、PD及路易体痴呆(dementia with Lewy bodies,DLB)等神经变性疾病中共同存在。这些发现强烈提示LRRK2可能成为干预AD、PD等神经变性疾病的潜在有价值的药理靶点。

LRRK2 某些位点突变(如G2019S、R1441C)可引起LRRK2酶活性异常增高和功能异常[2,36]，从而引起神经毒性。针对LRRK2酶活性的治疗可能成为神经变性疾病的一种治疗手段。部分研究者致力于开发临床适用的小分子LRRK2激酶抑制剂。目前，LRRK2激酶抑制剂的开发取得了显著进展。最近DNL201LRRK2激酶抑制剂进入了健康志愿者的Ⅰa期临床试验。尽管尚不清楚其潜在的长期副作用，但现有的结果显示志愿者可以耐受急性LRRK2抑制作用，因此有希望在未来进入临床使用[37]。

尽管LRRK2激酶抑制剂的开发和使用在基础研究领域取得了令人鼓舞的进展，但其确切的LRRK2生物学功能及药理抑制作用目前尚不清楚。越来越多的证据表明，遗传基因效应和外周免疫之间的相互作用改变了神经变性疾病发病风险。LRRK2激酶抑制剂的抗炎特性可能通过下调小胶质细胞或外周免疫来改变疾病病理进展，在早期延缓LRRK2突变风险携带者高炎症水平的发病时间[38]。

最后，值得注意的是，针对LRRK2的治疗方法除了小分子激酶抑制剂之外，有研究报道LRRK2反义寡核苷酸(LRRK2ASO)可以降低临床前疾病模型大脑中LRRK2的表达水平[39]。LRRK2ASO治疗的安全性和耐受性的Ⅰ期试验(BIIB094)也已证明了其疗效和安全性。鞘内注射ASO，可以避免干扰外周的LRRK2表达。设计独特的LRRK2特定突变体和(或)针对不同组织(细胞群)的靶向疗法可能是有益的。但仍然需要进一步了解LRRK2在免疫系统中的作用及LRRK2相关激酶调节炎症性疾病的机制，才能有效地在神经系统变性疾病中优化使用靶向LRRK2制剂，改善神经变性疾病的症状及病理损害，从而延缓疾病进程。