星点设计-响应面法优化黄芪多糖提取工艺实验研究*

吴 岚，马秀梅，杨桂林，曾海生，谭雨坪

(1 梧州市食品药品检验所，广西 梧州 543002；2 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；3 广西中医药大学，广西 南宁 530200)

黄芪是临床常用的中药之一，为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]，具有补气升阳、固表止汗之功效[2]。现代研究表明，黄芪含有黄酮类、多糖、皂苷类及氨基酸、微量元素等成分[3-4]。黄芪具有抗肿瘤、保护心脑血管、提高免疫功能、保护肺功能、调节血压等药理作用[5-6]。黄芪多糖具有抗动脉粥样硬化、保护视网膜、抗衰老等药理作用[7-8]。课题组开展黄芪多糖提取工艺的研究工作，是为了获得比较理想的中药多糖提取效率，为大规模生产提供实验依据。为了提高实验优化结果的可信度，本研究在通过运用正交试验，优化验证实验结果选取的实验因素是包含最佳实验点的参数下，再次通过运用响应面优选提取时间、提取温度和液料比的最佳工艺参数。目的是为提高黄芪多糖的得率及黄芪中药质量控制提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

GL124-1SCN型电子分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；UV-1780紫外可见分光光度计，苏州-岛津仪器有限公司；HWS12水浴锅,上海一恒公司。

1.2 材料与试剂

黄芪药材,购于广东康美药业有限公司，经右江民族医学院附属医院药学部曾海生副主任药师鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根;D-无水葡萄糖(生产批号HA062217195)，宝鸡市辰光生物科技有限公司;乙醇、苯酚、浓硫酸等均为分析纯;水为纯水。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

取粉碎的黄芪样品1.0 g，精密称定，提取2次，每次加入30 mL无水乙醇溶液，水浴回流提取60 min，立即趁热把药液过滤，用热的无水乙醇冲洗3次，等到溶剂挥干后，将残渣和滤纸一同放入锥形瓶中，加纯水100 mL，水浴回流40 min，取出冷却至室温后，精密量取10 mL的回流液于离心管中，离心10 min，转速设为5000 r/min，之后再精密吸取离心后的上清液1 mL，至10 mL容量瓶中加蒸馏水定容，振摇均匀后，备用。

2.2 对照品溶液的制备

取葡萄糖对照品54 mg，经过105 ℃干燥至恒重，放置 50 mL的容量瓶中，加入适量纯水轻轻摇匀使其溶解，再加入纯水稀释定容至刻度，轻轻摇匀后，得葡萄糖对照品溶液，浓度为1.08 mg/mL。

2.3 实验测定方法

采用苯酚-硫酸法，分别吸取各组制备液的多糖溶液3 mL，放入15 mL的具塞试管中，加入体积1 mL的5%苯酚和5 mL的浓硫酸。将其轻轻摇匀后，先沸水浴上加热20 min，取出后冷水浴中冷却10 min，即得样品溶液。于紫外下测吸光度，波长设置为490 nm，并记录数据。

2.4 回归方程的建立

分别吸取0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5和2.0 mL的对照品溶液置25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，蒸馏水作为空白对照，按照2.3项下的测定方法进行测定，检测波长为490 nm，测其吸光度绘制标准曲线，纵坐标(Y)为吸光度(A)，横坐标(X)为葡萄糖溶液浓度(c)，最终得到的回归方程为：Y=0.06108X+0.01185，相关系数r2=0.9993，结果表明：在0.00864～0.0864 mg/mL范围内，配制的葡萄糖溶液浓度与吸光度呈现出良好的线性关系。黄芪多糖得率计算：

多糖得率=4X/1000m×100%

式中：X为总多糖的浓度(由回归方程计算出)，m为黄芪样品重量。

2.5 单因素试验

2.5.1 提取时间的考察

将粉末过三号筛后，取1.0 g黄芪粉末，提取时间分别设为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，制备样品溶液(按照“2.1项”下的实验步骤)，然后按照2.3项下的方法测其吸光度，最后确定合适的纯水提取时间，结果见图1。

郭启明辞职来到洛阳的时候，身上只有6万多元的存款。在和关小美同居的这段时间，两个人过得很潇洒，经常从宜阳坐车去洛阳城市里玩，还给她你买衣服首饰等，很快所剩无几。情急之下，郭启明只得打电话向父亲求助，最后还是父母把15万块养老钱给了他救急。

图1 提取时间对多糖得率的影响Fig.1 The effect of extraction time on the yield of polysaccharides

从结果可知，水提时间对黄芪多糖的提取影响明显，多糖得率跟着水提时间的增加而逐渐升高，在40 min时到达最位置，而后逐渐下降，因而选择30 min、40 min、50 min三个水平进行正交试验及响应面优化设计。

2.5.2 提取温度的考察

将黄芪粉末过三号筛后，取1.0 g黄芪粉末，设置水提时间为40 min，水提温度分别设为50、 60、70、80、90、100 ℃，制备样品溶液(按照“2.1项”下的实验步骤)，然后测其吸光度(按照2.3项下的方法)，实验考察中确定合适的水提温度，实验结果见图2。

图2 实验温度对多糖得率的影响图Fig.2 The effect of experimental temperature on the yield of polysaccharides

从结果可知，水提温度对黄芪多糖的提取影响明显，黄芪多糖提取率随着实验水提时间的延长而增加，当达到温度 90 ℃最高位置，而后逐渐下降，因此选取温度80 ℃、90 ℃、100 ℃三水平进行正交试验及响应面优化设计。

2.5.3 液料比的考察

将黄芪粉末过三号筛后，取1.0 g黄芪药材粉末，分别加入纯水体积为20、30、40、50、60 mL，水提时间为40 min，水提温度为90 ℃，制备样品溶液(按照“2.1项”下的实验步骤)，然后测其吸光度(按照2.3项下的方法)，确定合适的液料比，结果见图3。

图3 料液比对多糖得率的影响图Fig.3 The effect of the ratio of material to liquid on the yield of polysaccharides

根据实验数据，由数据分析结果可知，实验条件料液比对中药黄芪多糖的提取率影响比较显著，随料液比的增加，多糖的提取率也上升，在1:40时到最高位置，而后逐渐下降，因而选择30:1、40:1、50:1 mL/g三水平进行正交试验及响应面优化设计。

2.6 正交试验

表1 试验提取方法考察因素水平表Table 1 Test extraction method investigating factor level table

表2 黄芪多糖实验提取方法考察试验结果(n=3)Table 2 Astragalus polysaccharides experimental extraction method inspection test results(n=3)

由表2可知，各实验考察因素对黄芪多糖提取的影响顺序(A>B>C)，由表3软件方差分析可知，实验提取时间对黄芪多糖得率有显著性，而水提温度和液料比没有统计学意义，因此水提温度和液料比无显著性差异，故最佳提取工艺为A2B3C2。即提取时间为40 min，提取温度为100 ℃，投料比为40:1(mL/g)。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.7 响应面方法分析黄芪多糖提取工艺

从2.5项下的考察单因素试验结果分析研究发现，黄芪多糖得率影响效果明显主要因素是提取时间、提取温度、液料比，但正交试验设计与单因素实验考察结果有所不同，正交试验数据分析得出，只有水提时间因素具有显著性差异。因而，为了综合研究中药黄芪多糖的最佳提取工艺条件，本实验依据Box. Benhnken的中心设计组合分析原理，数理统计分析比较单因素试验与正交试验设计结果，采用三因素三水平，利用响应面的方法分析。结果见表4～表5。

表4 响应面方法-因素与水平设计表Table 4 Response surface method-factor and level design table

表5 Box-Behnken 试验设计以及响应值Table 5 Box-Behnken experimental design and response values

试验数据分析的实验响应结果，然后与试验各单因素因素实验水平比较，进行相关试验回归拟合，得到的线性回归方程为如下：

Y=7.65+0.82A+0.35B-0.3C-0.54AB-0.12AC+0.12BC-1.64A2-0.72B2-0.91C2

从表6的数据可以分析知道，该实验模型设计分析结果非常显著(P<0.05)，而失拟项P=0.1476>0.05，结果表明响应值与预测值之间有良好的拟合度，因此该实验模型可用来预测黄芪多糖最佳的提取工艺。提取时间(P=0.0325<0.05)，提取温度(P=0.1207>0.05)，液料比(P=0.0868>0.05)，说明黄芪多糖的提取受提取时间影响显著，而提取温度与液料比对黄芪多糖的提取影响不显著。

表6 响应面中的各项回归方程方差分析结果Table 6 ANOVA results of various regression equations in the response surface

本实验采用Design Expert 10.0.1软件分析，结果分析并得出黄芪多糖的最优提取工艺：提取时间为42 min，提取温度为98.32 ℃，液料比为42.81:1时，黄芪多糖得率为6.98%，较高。为了方便试验，微微调整试验方案，设置提取时间为 40 min，提取温度为98 ℃，液料比为40:1，该结果也与正交试验的结果相近，在此工艺条件下进行的试验(n=3)，黄芪多糖得率分别为7.10%、6.95%、7.04%，试验接近预测值，说明该多糖提取工艺稳定、可行。

3 结 论

在正交试验中，提取时间对黄芪多糖含量的影响明显，而提取温度、液料比的显著性不高，提取温度和液料比这两个因素有明显的交互作用在实验中的表现出来，这对多糖含量有较大的影响，因而提取时间、提取温度、液料比这三种因素对黄芪多糖含量的影响不仅是线性关系。所以，用这两种方法进行对比结果显示，响应面法则能更好地阐释多因素与响应值两者的关系。当前，在提取药材的工艺研究中发现，应用较多的则是正交试验[9]，该方法可直观地分析所得结果，然而它得到的优选值，具有一定的局限性，因为只能是试验所用水平的某一种组合。采用一系列的实验数据用多项式进行拟合，分析得到回归方程，而后将函数用图形的方式直观地表现出来的方法称为响应面法，该方法能对所得结果关系直观地研究进行分析。