喜树碱对草地贪夜蛾幼虫中肠细菌群落组成及多样性的影响

舒本水，戴静华，余竟成，杨仙妹，林进添

(仲恺农业工程学院，广州市亚热带果树重大疫情控制重点实验室，广州 510225)

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda属鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae昆虫，原产于美洲热带和亚热带地区，是一种重大迁飞性害虫(王磊等, 2019; 郭井菲等, 2019)。其食性杂，可为害包括玉米、花生、大豆、甘蔗等在内的76科353种植物，其中玉米等禾本科植物是其嗜好寄主(Montezanoetal., 2018)。2015年以前草地贪夜蛾主要分布于美洲地区，随后在2016年和2018年分别入侵非洲和亚洲(Wangetal., 2020; Zhouetal., 2020)。草地贪夜蛾于2018年12月至缅甸入侵我国云南，已扩散到我国20个省(自治区)，对我国粮食生产安全造成严重威胁(廖永林等, 2020)。化学杀虫剂的使用是防治草地贪夜蛾最为直接有效的方法，双酰胺类、乙基多杀菌素、甲维盐等药剂对草地贪夜蛾表现出很好的防治效果(鲁艳辉等, 2019; 赵胜园等, 2019; 吴正伟等, 2019; 郑群等, 2019)。但由于繁殖速率快及大量的化学药剂防治，导致我国草地贪夜蛾对有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、双酰胺类杀虫剂的抗性问题已经产生，主要表现为作用靶标如乙酰胆碱酯酶、神经膜钠离子通道及鱼尼丁受体等发生抗性相关的突变(梁沛等, 2020; Zhaoetal., 2020; Guanetal., 2021)。因此，探究生物源化合物对草地贪夜蛾的防治效果可为缓解草地贪夜蛾抗药性的产生提供新思路。

喜树碱(Camptothecin, CPT)属单萜类吲哚生物碱，最初在我国特有树种喜树Camptothecaacuminata中分离鉴定(Leeetal., 2020)。喜树碱通过抑制DNA拓扑异构酶I(TOPO I)活性导致DNA合成受阻，进而起到抗肿瘤活性(Wangetal., 2019)。此外，研究发现喜树碱对多种昆虫表现出一定的杀虫活性。例如：0.2%喜树碱乳油对褐飞虱Nilaparvatalugens，甘蓝蚜Brevicorynebrassicae及二化螟Chilosuppressalis表现出较高的毒杀活性(Maetal., 2010)。喜树碱与苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensisvar.kurstaki或核型多角体病毒混用可增强对粉纹夜蛾Trichoplusiani及甜菜夜蛾Spodopteraexigua的毒杀及侵染活性(Sunetal., 2012)。目前喜树碱对草地贪夜蛾相关研究较少。研究发现喜树碱对草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf9具有抑制生长及凋亡诱导作用(Huangetal., 2013; Jiangetal., 2018)。我们前期采用混有喜树碱的人工饲料饲喂草地贪夜蛾幼虫，结果发现幼虫的生长发育受到显著抑制，且中肠组织结构受到严重破坏(Shuetal., 2021)。

昆虫肠道微生物是宿主昆虫的重要组成部分，在宿主昆虫整个生命周期中具有重要作用(周帆等, 2020)。昆虫肠道微生物不仅参与调控宿主昆虫消化食物及交配繁殖等多种生理活动，同时在调节宿主昆虫的免疫系统抵御外界病原入侵、诱导宿主昆虫产生抗性、加速有害物质降解及调控宿主昆虫的行为活动等方面发挥着重要作用(吴晓露等, 2019; 周帆等, 2020)。当前已有研究关注于草地贪夜蛾肠道微生物。研究发现变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes是草地贪夜蛾肠道微生物最主要的细菌门，而拟杆菌门Bacteroidetes和放线菌门Actinobacteria比例较低(Gichuhietal., 2020)。草地贪夜蛾肠道微生物受多种因素影响。例如，草地贪夜蛾前肠和中肠微生物群落之间存在明显差异，表明不同肠道微生物在同一宿主的定殖位置不同(Jonesetal., 2019)。草地贪夜蛾肠道微生物群落滴度与其发育阶段有关，幼虫虫体越大肠道微生物菌群越多；同时幼虫与成虫之间细菌微生物多样性同样存在差异，部分重要的幼虫细菌群在变态发育过程中发生丢失(Masonetal., 2020; Gichuhietal., 2020)。此外，不同寄主植物对草地贪夜蛾中肠细菌群落具有显著影响，其中取食大豆的草地贪夜蛾幼虫肠道细菌群落比取食玉米的幼虫肠道菌群更多样化(Jonesetal., 2019)。田间杀虫剂选择压力下的草地贪夜蛾幼虫肠道微生物群落比实验室筛选的抗性种群的幼虫肠道微生物更丰富，同时存在多种能够代谢杀虫剂的肠道细菌(Gomesetal., 2020)。然而，目前关于植物次生代谢产物对草地贪夜蛾肠道微生物的影响少有报道。本研究采用Illumina Miseq高通量测序技术分析喜树碱处理对草地贪夜蛾幼虫中肠细菌群落组成和多样性的影响，为后续深入探究草地贪夜蛾肠道细菌与杀虫剂代谢和抗性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

草地贪夜蛾实验室种群采自于广东省广州市从化区玉米种植田，于人工培养箱内以人工饲料连续饲养15代以上。饲养条件如下：温度25℃±1℃，相对湿度70%±5%，光周期12 L ∶12 D。选取4龄幼虫作为供试昆虫。

1.2 供试药剂

喜树碱(纯度为99.79%)购于上海蓝木化工有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购于北京索莱宝生物科技有限公司；土壤DNA提取试剂盒E.Z.N.A.©soil DNA Kit购于美国Omega Biotek公司；胶回收试剂盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit购于美国Axygen Biosciences公司；NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit购于美国Bioo Scientific公司。

1.3 喜树碱处理及幼虫中肠内容物收集

喜树碱溶于DMSO后制备为5×103μg/mL母液。取适量母液加入人工饲料进行混匀，然后加入琼脂粉溶液进行定型，最终制备成终浓度为1 mg/kg的加药人工饲料。对照组人工饲料加入等量的DMSO。随机选取生长一致的4龄幼虫进行不同饲料的饲喂。饲喂3天后用75%乙醇溶液对虫体进行消毒，然后无菌水清洗。在超净工作台中进行虫体解剖，同时用灭菌离心管收集中肠内容物。每个处理进行3次生物学重复，每20头虫的肠道内容物作为一个重复。

1.4 幼虫肠道内容物DNA提取及PCR扩增

采用E.Z.N.A.©soil DNA Kit，参照操作说明书提取不同处理组幼虫肠道内容物DNA。使用紫外超微量核酸蛋白仪NanoDrop 2000(赛默飞公司，美国)检测DNA的浓度及纯度。以提取的DNA为模板进行细菌16S rRNA V3-V4区域PCR扩增。扩增所采用的通用引物为338F (5′-ACTCCT ACGGGAGGCAGCAG-3′) 及806R (5′-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3′)。具体20 μL PCR反应体系如下：5 ×TransStartFast Pfu buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，上下游引物各 0.8 μL，TransStartFast Pfu DNA Polymerase 0.4 μL，模板DNA 10 ng，最后加ddH2O补足20 μL。PCR反应程序为：热启动95℃，3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，27个循环；然后72℃延伸10 min；最后4℃保存。PCR反应重复3次。最后PCR产物采用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测及AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行DNA条带的纯化回收。

1.5 Illumina测序及序列分析

将回收的PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司Illumina Miseq平台进行双端测序。首先采用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库，然后将构建的文库于Miseq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序。测序完成后，使用fastp软件(https://github.com/OpenGene/fastp, version 0.20.0)对原始测序序列进行质控，使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash, version 1.2.7)软件进行拼接。使用UPARSE软件(http://drive5.com/uparse/, version 7.1)，在97%的相似度水平对序列进行 OTU 聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/, version 2.2)及Silva 16S rRNA数据库(v138)对每条序列进行物种分类注释，设置比对阈值为70%。

2 结果与分析

2.1 序列拼接组装及OUT聚类分析

对6个草地贪夜蛾幼虫中肠内容物样本进行16S rDNA高通量测序，共获得295 028条有效reads，且序列平均长度为424.70 bp，具体各个样本详细测序数据见表1。在97%相似水平对reads进行聚类分析共得到262个OUTs。进一步对OUT注释，结果表明草地贪夜蛾中肠细菌被分类为17个门35个纲80个目123个科191个属246种。从对照组的草地贪夜蛾中肠内容物样本中共得到143 370条reads，聚类分析得到207个OUTs。进一步注释分析发现细菌被注释到14个门31个纲70个目101个科151个属196种。喜树碱处理的草地贪夜蛾幼虫中肠内容物样本经测序共得到151 658个 reads，聚类分析得到172个OUTs，注释到15个门26个纲54个目85个科133个属167个种。

表1 草地贪夜蛾幼虫中肠内容物16S rDNA测序原始数据

2.2 喜树碱对草地贪夜蛾中肠细菌群落组成的影响

在草地贪夜蛾中肠内容物细菌注释的18个门中，厚壁菌门Firmicutes和变形菌门Proteobacteria为所有样品中的优势菌群。厚壁菌门Firmicutes在所有样品中丰度最高，对照组草地贪夜蛾中肠细菌群落中厚壁菌门Firmicutes占95.35%，而喜树碱处理后厚壁菌门Firmicutes所占比例显著下降，为80.54%。变形菌门Proteobacteria在对照组草地贪夜蛾中肠细菌群落中占3.83%，而喜树碱处理后变形菌门Proteobacteria比例显著增加，为18.34%(表2)。

表2 喜树碱对草地贪夜蛾中肠细菌群落优势菌门的影响

从属水平分析，肠球菌属Enterococcus、乳杆菌属Lactonacillus、醋菌属Acetobacter、不动细菌属Acinetobacter、葡糖桿菌属Gluconobacter、短波单胞菌属Brevundimonas、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas为草地贪夜蛾中肠优势细菌属。统计分析结果表明肠球菌属Enterococcus、乳杆菌属Lactonacillus占各样品微生物群落比例最高，但是喜树碱处理后两属细菌之间所占整个细菌群落比例无显著性差异。此外，统计分析结果表明其他属在两种处理之间也无显著性差异(图1)。

图1 不同样品中属水平细菌群落热图Fig.1 Community heatmap analysis on genus level in different samples注：CK，对照组；CPT，喜树碱处理组。Note: CK，control group; CPT，camptothecin treatment group. 肠球菌属，Enterococcus；乳杆菌属，Lactonacillus；醋菌属，Acetobacter；不动细菌属，Acinetobacter；葡糖桿菌属，Gluconobacter；短波单胞菌属，Brevundimonas；嗜麦芽窄食单胞菌，Stenotrophomonas.

从物种水平上分析发现正常人工饲料饲喂的草地贪夜蛾幼虫中肠细菌种数为196种，而喜树碱处理后中肠细菌物种数相对减少为167种。Veen图分析发现117种细菌为两者共有的物种，而有79种细菌为正常人工饲料饲喂的草地贪夜蛾幼虫特有物种，另外有50种细菌为喜树碱处理后草地贪夜蛾幼虫特有物种(图2)。

图2 不同处理组间细菌物种Veen图分析Fig.2 Veen diagram analysis of bacterial species between control and CPT treatment groups注：CK，对照组；CPT，喜树碱处理组。Note: CK，control group; CPT，camptothecin treatment group.

在对照组中丰度前10位的物种为：蒙氏肠球菌Enterococcusmundtii(72.90%)，短乳杆菌Lactobacillusbrevis(22.06%)，不动杆菌Acinetobacter(2.12%)，寡养单胞菌Stenotrophomonas(0.36%)，植物乳酸杆菌Lactobacillusplantarum(0.28%)，巴氏醋杆菌Acetobacterpasteurianus(0.24%)，泡囊短波单胞菌Brevundimonasvesicularis(0.24%)，未知菌Saccharimonadaceae(0.17%)，红平红球菌Rhodococcuserythropolis(0.15%)，及缺陷假单胞菌Brevundimonasbullata(0.13%)。而喜树碱处理组中蒙氏肠球菌E.mundtii丰度明显下降，仅占26.80%；而短乳杆菌L.brevis(36.08%)，巴氏醋杆菌A.pasteurianus(22.03%)，不动杆菌Acinetobacter(6.90%)，弗拉脱氏葡糖杆菌Gluconobacterfrateurii(1.48%)，寡养单胞菌Stenotrophomonas(1.03%)，泡囊短波单胞菌B.vesicularis(0.77%)，未知菌Saccharimonadaceae(0.55%)，缺陷假单胞菌B.bullata(0.44%)，红平红球菌R.erythropolis(0.38%)丰度明显升高(图3)。上述结果表明喜树碱显著改变草地贪夜蛾幼虫中肠细菌群落组成。

图3 喜树碱处理后草地贪夜蛾幼虫肠道细菌主要物种丰度比例变化Fig.3 Proportions of the main bacteria species in the midgut of Spodoptera frugiperda fed on different diets注：CK，对照组；CPT，喜树碱处理组。Note: CK，Control group; CPT，Camptothecin treatment group.

2.3 喜树碱对草地贪夜蛾幼虫肠道细菌多样性分析

2.3.1Alpha多样性分析

草地贪夜蛾中肠细菌组成Alpha多样性分析结果发现喜树碱处理组Shannon指数显著高于对照组，表明喜树碱处理组草地贪夜蛾幼虫中肠细菌群落多样性高于对照组。此外，喜树碱处理组Simpson指数显著低于对照组，表明喜树碱改变了幼虫中肠优势菌种的集中程度。同时喜树碱处理组ACE和Chao指数均低于对照组，但差异不显著，表明喜树碱处理组幼虫中肠群落丰富度略低于对照组(表3)。

表3 喜树碱对草地贪夜蛾幼虫肠道细菌α多样性指数的影响

2.3.2Beta多样性分析

采用Hierarchical clustering算法对6个样品进行门水平层级聚类分析，结果表明CK1、CK2及CK3聚在一支，而喜树碱处理组样品CPT1、CPT2及CPT3也成功聚在另一支(图4-A)。上述结果表明喜树碱处理改变了草地贪夜蛾中肠细菌群落，从而导致两组样品聚类在不同的分支。PCA分析结果与表明CK1、CK2及CK3中细菌群落聚在一起，说明对照组3个生物学重复之间细菌群落一致性较高。而喜树碱处理组3个生物学重复与对照组完全分开，且相对较为分散(图4-B)。上述说明喜树碱处理组细菌群落多样性与对照组之间存在差异，同时喜树碱处理组3个生物学重复之间也可能存在一定的细菌群落差异性。PCoA分析结果与层级聚类和PCA分析结果一致(图4-C)。上述结果表明喜树碱处理后草地贪夜蛾幼虫中肠细菌群落组成与对照组相比存在显著差异。

图4 草地贪夜蛾幼虫中肠细菌群落Beta多样性分析Fig.4 Beta diversity analysis of the midgut bacterial community of Spodoptera frugiperda larvae注：A，门水平层次聚类分析; B，所有样品OUT水平PCA分析; C，所有样品OTU水平PCoA分析。CK，对照组；CPT，喜树碱处理组。Note: A，Hierarchical clustering tree on Phylum level; B，Result of PCA analysis on OTU level in all the samples; C，Result of PCA analysis on OTU level in all the samples. CK，Control group; CPT，Camptothecin treatment group.

3 结论与讨论

昆虫的肠道微生物在昆虫整个生命历期的多种生命过程中具有重要的调控作用。作为一种高杂食性和重要粮食作物害虫，草地贪夜蛾肠道微生物也越来越受关注。本研究采用16S rDNA高通量测序技术对草地贪夜蛾幼虫中肠细菌群落组成进行了分析，通过聚类分析得到262个OTUs，注释到17个门35个纲80个目123个科191个属246种细菌。而前期Gichuhi等(2020)通过16S rDNA高通量测序将原始序列聚类得到1 796个OTUs，远超本研究得到的OUT数量。造成OUT数量差距的原因可能与草地贪夜蛾取食的材料不同有关。本研究采用的是人工饲料饲喂的草地贪夜蛾，而Gichuhi等则是取食大田玉米的草地贪夜蛾。本研究进一步证实取食的材料是影响昆虫肠道微生物组成的重要因素。通过对细菌群落组成进行分析发现厚壁菌门Firmicutes和变形菌门Proteobacteria为草地贪夜蛾中肠细菌群落中的主要优势菌门，与Gichuhi等(2020)分析结果一致。同时研究发现甜菜夜蛾Spodopteraexigua，落叶松毛虫Dendrolimussuperans以及舞毒蛾Lymantriadispar中的优势菌门同样为厚壁菌门Firmicutes和变形菌门Proteobacteria，推测两个门的细菌在夜蛾科昆虫肠道中发挥重要作用(Gaoetal., 2019; Zengetal., 2020a)。此外也有研究报道草地贪夜蛾肠道微生物中放线菌门Actinobacteria和未培养菌门Uncultured bacteria为优势菌门，两个门在肠道微生物中所占比例分别为37.41%和19.80%，而厚壁菌门Firmicutes和变形菌门Proteobacteria仅占1.68%和0.23%(Rozadillaetal., 2020)。推测产生这种差异的原因可能有两个：一是采集的草地贪夜蛾地理位置存在差异；二是测序方法不一致。本研究采用16S rDNA测序，而Rozadilla等(2020)则采用的是宏转录组测序。

同时研究发现植物防御物质和农药不仅调控鳞翅目昆虫肠道形态和消化酶活性，而且对昆虫肠道微生物也有一定的调控作用(Zengetal., 2020a)。例如，采用尼古丁或乌头碱处理后的落叶松Larixgmelinii和旱柳Salixmatsudana后分别饲喂落叶松毛虫D.superans以及舞毒蛾L.dispar幼虫，结果表明尼古丁或乌头碱显著影响两种昆虫幼虫肠道中的优势菌群及丰度(Zengetal., 2020a)。此外，辛硫磷处理的桑叶饲喂家蚕Bombyxmori幼虫不同时间，家蚕体重在72 h后显著降低，同时幼虫肠道细菌群落组成及结构均发生显著改变。其中辛硫磷处理组甲基杆菌属和金黄色葡萄球菌属比对照组显著降低，而一些非优势菌属葡萄状球菌显著增加(Lietal., 2020)。使用阿维菌素喷雾法处理舞毒蛾幼虫，24 h后收集肠道内容物并测序。结果表明阿维菌素显著改变舞毒蛾幼虫肠道细菌群落组成及多样性，表现为61.11%的肠道细菌丰度在阿维菌素处理组和对照组之间表现出显著差异，且9个分别存在于阿维菌素处理组和对照组的细菌属导致幼虫肠道多样性发生改变(Zengetal., 2020b)。作为一种植物源化合物，低浓度喜树碱对草地贪夜蛾具有显著的生长抑制作用(Shuetal., 2021)。在农业生产中可通过喜树碱与其它化学农药进行混配，增强化学药剂的防治效果及延缓草地贪夜蛾抗药性的发生与发展，具体的方案需要进一步研究。本研究采用混药法将喜树碱混合于草地贪夜蛾人工饲料并饲喂幼虫，收集肠道内容物进行16S rDNA测序。结果表明喜树碱显著改变草地贪夜蛾幼虫细菌群落组成和多样性。与对照组相比，喜树碱处理组厚壁菌门Firmicutes丰度显著降低，而变形菌门Proteobacteria显著升高。此外，种水平研究发现主要的细菌物种丰度受喜树碱影响较大。同时Alpha和Beta多样性分析结果表明喜树碱处理后显著改变草地贪夜蛾幼虫中肠细菌群落多样性。有研究表明植物防御物质通过与草地贪夜蛾肠道微生物相互作用改变肠道围食膜(peritrophic matrix，PM)的功能(Masonetal., 2019)。结合喜树碱处理抑制草地贪夜蛾幼虫生长发育及改变肠道结构等结果，推测喜树碱同样可能通过改变草地贪夜蛾幼虫中肠细菌群落来改变中肠结构，导致其对营养物质的消化吸收造成不利影响，但具体机制有待进一步探究。

本研究通过16S rDNA测序对草地贪夜蛾幼虫中肠内容物细菌群落进行分析。同时采用多种方法分析了喜树碱处理对草地贪夜蛾幼虫中肠细菌群落的组成和多样性的影响。本研究为进一步丰富草地贪夜蛾幼虫肠道微生物群落数据信息及探究喜树碱对草地贪夜蛾的作用机制提供一定的理论依据。