STAT3、NCK1 和VEGF 在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

李佳楠，陈春悠

（1.华北理工大学口腔医学院，河北 唐山 063000；2.唐山市工人医院头颈外科，河北 唐山 063000）

对于手术难以根除的难治型甲状腺癌，积极寻找特异性高、灵敏度强的分子标记物是十分必要的。STAT3 属于信号转导和转录活化因子（signal transducer and activators of transcription，STATs）家族成员，作为原癌基因可以加速癌细胞增殖，延缓癌细胞凋亡，帮助癌细胞逃脱免疫识别，诱导肿瘤血管生成并参与恶性肿瘤的侵袭和转移过程。非催化区域酪氨酸激酶1（non-catalytic region of the tyrosine kinase adaptor protein 1，NCK1）是一种信号内接头蛋白，参与细胞骨架重构，并与恶性肿瘤的侵袭和转移等过程密切相关。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）不仅参与肿瘤微血管的生成过程，还参与恶性肿瘤淋巴管生成等过程。本研究主要STAT3、NCK1、VEGF 在甲状腺乳头状癌中的表达水平、相关性以及与甲状腺临床病理特征之间的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标本来源 收集2019 年9 月-2020 年12 月唐山市工人医院头颈外科病理诊断明确的甲状腺乳头状癌组织63 例、甲状腺腺瘤组织32 例、正常甲状腺组织（选取距离肿瘤病灶大于2 cm，经病理证实无异常的甲状腺组织）20 例。所有病例临床资料完整，病理诊断明确，且取材前无其他头颈部肿瘤史及放化疗史，均为第1 次接受甲状腺外科手术。

1.1.2 实验试剂 兔抗人STAT3 多克隆抗体、兔抗人NCK1 多克隆抗体、兔抗人VEGF 多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；DAB 试剂盒、PV6000 通用型试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法 采用免疫组化SP 法染色，具体实验操作步骤按试剂说明书操作。阳性对照以试剂公司提供的阳性切片作为标准，阴性对照以PBS 液代替一抗作为标准。

1.3 结果判读 STAT3、NCK1 的表达主要定位于细胞质，其次为细胞核；VEGF 的表达定位于细胞质，表现为弥散的颗粒状染色。采用双盲法由2 名病理科医生在400 倍高倍镜下随机选取5 个不少于100个细胞的视野，取其平均值。评判标准[1]：阴性（-）：基本无着色；弱阳性（+）：≤10%的细胞呈现不同程度的细胞质着色；阳性（++）：10%～30%的细胞呈现强的棕褐着色的细胞质着色，或≤70%的细胞呈现弱或中等强度的细胞质着色；强阳性（+++）：＞30%的细胞呈现强的棕褐着色的细胞质着色或＞70%的中等强度细胞质着色。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计软件进行数据处理，对实验结果进行统计分析。计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验或Fisher精确概率法；采用Spearman秩相关性分析甲状腺乳头状癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表达的关系。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同甲状腺组织中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表达情况比较 甲状腺乳头状癌中STAT3、NCK1、VEGF 阳性表达率高于甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；而甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织中STAT3、NCK1、VEGF 阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 不同甲状腺组织中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表达情况比较[n（%）]

2.2 甲状腺乳头状癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白与临床病理的关系 STAT3 阳性表达与肿瘤直径、是否伴有颈部淋巴结转移相关（P＜0.05），而与性别、年龄、病灶数、是否侵犯甲状腺外被膜、是否合并桥本甲状腺炎无关（P＞0.05）；NCK1 阳性表达与是否伴有颈部淋巴结转移相关（P＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤直径、病灶数、是否侵犯甲状腺外被膜、是否合并桥本甲状腺炎无关（P＞0.05）；VEGF 阳性表达与肿瘤直径、是否侵犯甲状腺外被膜和是否伴有颈部淋巴结转移相关（P＜0.05），而与性别、年龄、病灶数、是否合并桥本甲状腺炎无关（P＞0.05），见表2。

表2 甲状腺乳头状癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白与临床病理的关系[n（%）]

表2（续）

2.3 甲状腺乳头状癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表达的相关性分析 甲状腺乳头状癌中STAT3 与NCK1 的表达呈正相关（r=0.483，P＜0.05）；STAT3 与VEGF 的表达呈正相关（r=0.584，P＜0.05）；NCK1 与VEGF 的表达呈正相关（r=0.477，P＜0.05）。

3 讨论

恶性肿瘤的生长发育过程中往往由于空间有限而伴随着缺氧、高压、高渗等环境，在这种恶劣环境中，肿瘤微血管生成和抑制的平衡关系被打破，癌细胞内各种调节血管内皮生长的基因开始表达并参与到肿瘤微血管生成的过程中，为肿瘤提供血液和氧气，使得肿瘤体积不断增大。同时，肿瘤微血管生成也是恶性肿瘤侵袭和转移行为的基础[2，3]。肿瘤微血管的形成与恶性肿瘤的不良生物学行为和预后直接相关，因此研究肿瘤微血管生成的相关调节因子，以及其可能存在的作用机制对于患者预后的评估和未来肿瘤治疗靶点的探索有着积极意义。

VEGF 在肿瘤血管生成的过程中扮演着不可或缺的角色。头颈部肿瘤，如下咽癌[4]、口腔癌[5]、甲状腺癌[6]，因其生长空间有限，使得局部缺氧环境更加容易形成，最终造成肿瘤微血管的形成。在目前已知的肿瘤微血管形成的过程中，肿瘤血管内皮细胞通过自分泌和旁分泌VEGF，进而参与诱导肿瘤内部形成新生微血管，并造成血管内皮生长和抑制的失衡。此外，新生微血管的形成造成肿瘤内部微环境改变，形成缺氧环境，缺氧诱导因子活化后使得VEGF 的转录程度进一步增强，加剧了肿瘤微血管的生成，从而使得肿瘤不断获取养分而生长发育[7]。VEGF 不仅参与调控肿瘤微血管的生成过程，还参与肿瘤的转移过程。同时，VEGF 可以协同VEGF-C通过直接和间接的方式促进肿瘤细胞通过微淋巴管转移至全身。另外，VEGF 通过增加淋巴管上皮的通透性和改变细胞粘附性等手段促进恶性肿瘤通过淋巴管转移，参与其转移过程[8，9]。NCK1 定位于人的染色体3q22.3，位于细胞质中，是一种信号转导和转化蛋白。NCK1 具有Src 同源性2 和3 结构域，即SH2和SH3 结构域，而SH2 和SH3 结构域也赋予了NCK1 参与细胞骨架重构、细胞分裂增殖和迁移过程的能力[10-12]。Morris DC 等[13]研究发现，NCK1 作为原癌基因可以促进乳腺癌的侵袭和肺转移等过程，当NCK1 被抑制表达时，乳腺癌细胞的侵袭性降低。Xia P 等[14]通过免疫组化、Western blot、ELISA 检测等手段证实了NCK1 参与调节宫颈鳞癌微血管生成的过程，其通过上调VEGF 的表达，从而诱导宫颈癌肿瘤微血管的形成，使肿瘤侵袭和转移行为获得养分支持。STATs 家族存在于细胞浆中，是一类具有信号转导和转录调控功能的蛋白家族。STAT3 作为原癌基因，在正常组织中的激活受到严格把控，而在恶性肿瘤中，STAT3 持续的激活可以诱导Bcl-2、c-Myc 和Bcl-XL 过度表达，导致肿瘤细胞持续增殖，也可以参与肿瘤细胞逃避免疫识别、促进血管生成过程中关键基因的转录[15，16]。伍婧等[17]研究发现，结肠癌中STAT3 与VEGF 的表达明显升高，且与结肠癌的血管生成密切相关。

本研究通过免疫组化法检测并比较了STAT3、NCK1、VEGF 在甲状腺乳头状癌、甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织中的表达水平，结果发现甲状腺乳头状癌中STAT3、NCK1、VEGF 阳性表达率高于甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织，差异有统计学意义（P＜0.05），提示三者可以作为鉴别不典型甲状腺良恶性肿瘤的指标。通过对甲状腺乳头状癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白与临床病理的关系进行分析，结果发现甲状腺乳头状癌中肿瘤直径越大，STAT3 和VEGF 的表达越显著，说明二者参与了甲状腺乳头状癌的生长发育过程中，并在其过程中起到了促进作用。而VEGF 的表达情况还与癌灶是否侵犯甲状腺外被膜相关，表明VEGF 与甲状腺乳头状癌的侵袭性密切相关，随着甲状腺癌的不断进展，VEGF 的表达水平不断升高，最终导致癌灶向外侵袭，并突破被膜侵犯周围肌肉和神经组织。此外，STAT3、NCK1、VEGF 均与甲状腺乳头状癌患者的颈部淋巴结转移密切相关，提示三者均参与了甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的过程，检测三者的表达水平对鉴别患者是否发生颈部淋巴结转移有重要意义。甲状腺癌多来源于甲状腺滤泡上皮恶变，在恶变的过程中伴随着血管生成和抑制功能的失调，其中异常表达的VEGF 在诱导肿瘤新生血管形成的过程中起到了关键作用[18，19]。Zhang F 等[20]研究发现，在结直肠癌中NCK1 是STAT3 的一个下游信号分子，在STAT3 的调控下，NCK1 高表达并且参与促进了结直肠癌血管生成过程。本研究结果发现，甲状腺乳头状癌中STAT3 与NCK1 的表达呈正相关（r=0.483，P＜0.05）；STAT3 与VEGF 的表达呈正相关（r=0.584，P＜0.05）；NCK1 与VEGF 的表达呈正相关（r=0.477，P＜0.05），提示在甲状腺癌进展过程中STAT3、NCK1、VEGF 的表达同样存在较强的相关性，由此可以推断，STAT3 和NCK1 作为癌基因相互作用，可以诱导VEGF 表达，促使肿瘤微血管形成；同时三者还可通过协同作用，以直接或间接的方式促使甲状腺乳头状癌通过淋巴管向颈部转移，导致患者不良预后。

综上所述，STAT3、NCK1 与VEGF 三者在甲状腺乳头状癌中的表达水平高于甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织，可为临床鉴别不典型甲状腺良恶性肿瘤提供思路。此外，STAT3 和NCK1 不仅能诱导VEGF的表达，促进肿瘤血管生成，三者还可协同参与甲状腺乳头状癌的生长发育，侵犯甲状腺外被膜和颈部淋巴结转移过程。