miR-622 抑制物对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响研究

沈严严，文 南，汤 盼

（1.南华大学附属南华医院超声科，湖南 衡阳 421002；2.南华大学衡阳医学院，湖南 衡阳 421000）

乳腺癌（breast cancer）是除东非地区外，女性患者最常罹患的恶性肿瘤，也是全球11 个地区中因恶性疾病致死的最常见原因[1]。现如今乳腺癌的治疗方法主要有放疗、新辅助化疗、手术切除、靶向生物治疗等方式，但存在晚期转移、复发的风险，以及化疗药物耐药，给临床治疗带来了巨大困难[2]。因此，需要深入研究乳腺癌发病机制，寻找治疗乳腺癌的新通路、新靶点。微小RNA（microRNA，miRNA）通过与目标基因mRNA 互补结合负性调控mRNA 的稳定性或遏制其翻译效率从而调控生命活动，是一串内源性单链非编码RNA，其在乳腺癌中的致病作用机制的研究中已成为一大热点[3]。miR-622 近来被广泛报道是miRNA 家族中的主要成员，在多项研究中显示miR-622 可调控癌症相关通路抑制癌症发展，是癌症的抑制因子[4，5]。研究显示[4-6]，miR-622 在胃癌、乳腺癌等癌症中作用异常，而miR-622 在乳腺癌中起致癌还是抑癌作用仍存在争议。miRNA 在肿瘤中的作用机制通常与多种蛋白有关[7]。Wang X等[8]报道显示，miR-622 抑制K-Ras 的表达起抑癌作用。而生物信息学研究显示miR-622 也与EYA1有预测的可能结合位点。miR-622 与EYA1 在癌症中作用关系的研究尚不清楚，EYA1 是兼具有转录活性与磷酸酶活性的转录因子，最初在果蝇中被发现在调控眼睛形态发育中发挥重要作用。本研究采用qRT-PCR 检测人乳腺癌细胞株MCF-7 中miR-622 的表达情况，通过miR-622 inhibitor 抑制miR-622 的表达后观察癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化，以及乳腺癌细胞中EYA1 的表达情况，探讨miR-622 在乳腺癌发生、发展中的可能作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人乳腺癌细胞系MCF-7 从南华大学附属第一医院临床研究所获取；双抗、胎牛血清、胰酶、DMEM 培养基（美国Gibco 公司）；RIPA 细胞裂解液（上海雅吉生物科技有限公司）；Western blot试剂盒、BCA 试剂盒、HE 染色试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；GAPDH 一抗、EYA1 一抗、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（美国ABclonal 公司）；CCK-8 试剂盒、ECL 高效化学发光试剂盒（美国Genview 公司）；PVDF 膜（美国GE 公司）；预染蛋白marker（上海百赛生物科技有限公司）；通用型microRNA 提取试剂盒（北京金百特生物技术有限公司）；miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；DEPC 水（上海碧云天生物技术有限公司）；miR-NC、miR-622 inhibitor、Ribofactamine 试剂盒（广州锐博生物技术有限公司）；Matrigel（美国BD公司Becton，Dickinson and Company）。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 取对数生长期乳腺癌MCF-7 细胞接种于6 孔板中，待细胞生长融合度达30%～50%时，根据制造商提供的说明，使用Ribofactamine 转染试剂将miR-622 inhibitor、miR-NC 转染到MCF-7细胞中。设为miR-622 inhibitor 组、miR-NC 组，另设control 组。将细胞放到37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养。24～36 h 后，利用倒置荧光显微镜观测miR-622 的表达情况，并检测转染效率。

1.2.2 RNA 提取与qRT-PCR 检测 根据RNA 提取试剂盒说明提取细胞系中总RNA，使用反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA。合成特异性miRNA-622 引物和U6 内参引物。使用qRT-PCR 试剂盒进行检测。反应程序：预变性95 ℃10 s；95 ℃5 s，40×；溶解曲线程序：95 ℃60 s，55 ℃30 s，95 ℃30 s。完成定量后进行相对定量分析（2-△△Ct），得出miRNA-622 相对表达量。所有反应均进行3 次。

1.2.3 细胞增殖 根据说明用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖能力。转染后，收获稳定转染的MCF-7 细胞，并以每孔5.0×103个细胞的密度接种到96 孔板上，在37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养12、24、48 和72 h 后，分别用20 μl CCK-8 试剂处理细胞，并在37 ℃条件下孵育2 h。使用多功能酶标仪测量450 nm 处的OD 值。所有实验重复3 次。

1.2.4 细胞迁移 通过进行伤口愈合试验来评估细胞迁移能力。转染48 h 后，将对数生长期的MCF-7 细胞接种到6 孔板中，调整细胞浓度至2×105个/孔。待细胞生长融合度至80%～90%时，使用无菌的10 μl移液管尖端在每个孔的中心处划伤。细胞划伤后用磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS）洗去脱落的细胞，将剩余的细胞置于37 ℃培养12 h。在0 h 和12 h 分别用显微镜拍摄照片。对于每个图像，划痕两侧之间的距离使用ImageJ 软件进行测量。细胞迁移实验独立进行3 次。

1.2.5 细胞侵袭 根据制造商的说明，在Transwell 小室（Becton，Dickinson and Company，USA）中评估MCF-7 细胞侵袭能力。将Matrigel 预先包被在Transwell 上室，然后将转染48 h 后对数生长期各组细胞重悬于无血清培养基中，按照1×104细胞/孔的量接种在Matrigel 上。向下室中加入含有20%FBS培养基，置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养24 h。用棉签轻轻拭去上室的细胞和多余Matrigel 胶，4%甲醛固定10 min，PBS 清洗3 次后，根据HE 染色试剂盒染色。PBS 清洗后随机选取5 个显微镜下视野观察侵袭细胞数。

1.2.6 EYA1 蛋白检测 采用Western blot 试剂盒检测EYA1 蛋白表达水平。收集各组细胞，RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白样品进10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），转PVDF 膜。封闭液封闭2 h 后，加入一抗EYA1（1∶5000 稀释）或GAPDH（1∶5000 稀释），4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG（1∶5000 稀释），室温孵育1 h。用ECL 高效化学发光试剂盒检测条带，采用ImageJ 凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带吸光度，以目的条带和GAPDH 条带的比值作为蛋白表达水平。实验独立进行3 次。

1.3 统计学分析 利用SPSS 21.0 数据分析统计软件进行数据分析。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-622 inhibitor 转染后细胞中miR-622 表达水平及细胞增殖情况 miR-622 inhibitor 组中miR-622 相对表达量为（0.53±0.07），低于control 组的（1.05±0.06）及miR-NC 组的（1.03±0.10），差异有统计学意义（P＜0.05），见图1；CCK-8 实验结果显示，12 h 后，miR-622 inhibitor 组（0.41±0.23）增殖能力低于control 组（0.58±0.33）及miR-NC 组（0.55±0.31），差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图1 各组细胞中miRNA-622 的表达情况

图2 CCK-8 实验检测各组乳腺癌细胞中的增殖能力

2.2 miR-622 inhibitor 转染后细胞迁移情况 miR-622 inhibitor 组迁移率（21.31±6.91）%低于control组（39.89±9.32）%及miR-NC 组（32.47±7.82）%，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 细胞划痕试验测定各组乳腺癌细胞中的迁移能力

2.3 miR-622 inhibitor 转染后细胞侵袭情况 control组（160.33±11.93）及miR-NC 组（160.33±11.02）侵袭细胞数高于miR-622 inhibitor 组的（125.00±11.53），差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 Transwell 实验检测各组中乳腺癌细胞中的侵袭能力情况

2.4 miR-622 inhibitor 转染后细胞中EYA1 表达水平 Western blot 研究结论显示，miR-622 inhibitor组细胞EYA1 蛋白相对表达水平为（3.77±0.27），高于control 组的（1.04±0.04）和miR-NC 组的（0.97±0.07），差异有统计学意义（P＜0.05），提示miR-622可能调控EYA1 的表达，其中miR-622 呈负向调控，见图5。

图5 Western blot 检测各组EYA1 蛋白的表达水平

3 讨论

乳腺癌是全世界女性因癌症致死的最常见原因，对乳腺癌的诊疗技术的探讨仍是一大热点。虽然目前通过手术切除、新辅助化疗、放疗、中医和靶向治疗等综合方法，乳腺癌的发展得到一定缓解，但5 年总生存率仍然较低[1]。因此迫切需要了解乳腺癌的分子发病机制，从分子水平探讨治疗乳腺癌的可能性以及开发用于靶向治疗药物，对乳腺癌进行精准治疗，提高患者生存率。miRNA 对肿瘤的调控作用越来越受到重视[7]。既往研究表明[8，9]，miRNA 影响了癌细胞的增值、转移与侵袭，与肿瘤的发生、发展及转移密切相关。

miRNA 与靶基因信使RNA（mRNA）结合来调节mRNA，从而影响生命活动，参与疾病的发生发展[3]。既往研究显示[10]，miR-622 位于人染色体13q31.3 区域，在多种肿瘤中异常表达，靶向调节不同信号通路在多种癌症中发挥作用。但有关miR-622 在乳腺癌中的参与机理的研究甚少。本研究采用了在乳腺癌细胞中转染miR-622 inhibitor 下调癌细胞中miR-622 后发现，与control 组以及miRNC 组比较，miR-622 inhibitor 组中癌细胞增殖、迁移和侵袭力均显著减弱这一现象，并由此证明了miR-622 的表达可以参与乳腺癌细胞的生长过程，抑制miR-622 表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭从而参与了抑制乳腺癌细胞转移的进程。此研究中提示miR-622 在乳腺癌的增殖、迁移和侵袭中起促进作用。魏晰麟等[10]研究发现，在结肠癌中miR-622 表达是升高的，促进miR-622 的表达水平后可下调DYRK2 表达并使得SW1116 细胞侵袭转移作用增强。李仲均等[11]研究显示，miR-622 在卵巢上皮性癌组织中表达增高可能发挥促癌作用。说明miR-622 确实可通过影响某些通路而促进癌症的转移与发展，产生促癌作用。然而有研究结果显示miR-622 的表达在胶质母细胞瘤、甲状腺乳头状癌等癌症中上调。Wang X 等[8]的研究，在胶质母细胞瘤的进展中，增高的miR-622 抑制K-Ras 的表达从而发挥了遏制癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。通过靶向调节c-Myc，miR-622过度表达抑制胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而抑制miR-622 则产生相反的结果[9]。上述研究中提示上调miR-622 可抑制肿瘤的发生发展过程，而抑制miR-622 可减弱这一作用。Orlandella FM 等[4]及Liu C 等[5]的研究显示，高表达miR-622 抑制乳腺癌细胞的转移，本研究结果与上述研究存在差异，可能通过不同的信号通路以及与不同的分子协作或拮抗发挥不同的作用有关。miR-622 家族对促进或抑制肿瘤发生发展的作用方面的研究存在不同意见。

为了进一步研究miR-622 调控乳腺癌细胞的机制，本研究根据生物信息学，寻找到EYA1 基因与miR-622 具有结合位点，用Western blot 检测了miR-622 inhibitor 转染后细胞中EYA1 表达水平，试图寻找EYA1 基因与miR-622 存在关联的证据。EYA1 即“果蝇眼缺失”基因，是与果蝇眼睛形态发育有关的重要调控因子[12]。在人类身上，EYA 基因家族的缺失或突变，会造成一种常染色体显性遗传性疾病，即鳃-耳-肾综合征，该病以肾脏发育异常或缺失、鳃裂发育异常、耳前瘘管以及听力损失为特征[13-15]。近年来，有关EYA1 在各种肿瘤恶性进展中的作用机制的研究得到大量关注。然而有关EYA1 在乳腺癌中的作用机制的研究报道较少，本研究在乳腺癌细胞中转染miR-622 抑制物后发现EYA1 表达增高，说明抑制miR-622 表达可上调EYA1 的水平，结果提示miR-622 可能负调控EYA1 的表达。在本研究中，抑制miR-622 表达可能对癌细胞增殖起削弱作用，同时EYA1 的表达水平升高，实验提示miR-622 水平降低有可能通过调控EYA1 来实现对乳腺癌细胞增殖的抑制作用。在本研究中，EYA1 可能起抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭的作用，而在某些研究中EYA1 却扮演着促癌基因的角色。Kong D 等[16]发现在肝细胞癌中，EYA1与侵袭性以及不良预后有明显的关联，研究显示在肝细胞癌中EYA1 的表达提高，并且可使得肝癌细胞的迁移和侵袭作用加强。Cai S 等[17]探究结直肠癌中的发病机理时，发现EYA1 表达水平增高可诱导促进结直肠癌转移。且Guan H 等[18]的研究探讨了EYA1 在乳腺癌中的作用，结果提示靶向下调EYA1 减弱了乳腺癌细胞的增殖作用。在癌症发生机制中，一般存在多种因素相互作用产生抑癌或促癌效果，EYA1 在乳腺癌中的具体作用仍是需要研究的方向，目前尚无实验证据证明miR-622 是否与EYA1 存在结合位点，且miR-622 下调EYA1 是否在乳腺癌的发病机制中发挥效果以及可能存在的具体信号通路仍有待进一步探讨。

综上所述，上述研究提示抑制miR-622 的表达后可抑制乳腺癌的增殖、侵袭与迁移，抑制乳腺癌的转移，miR-622 是肿瘤发生、发展过程中的重要环节，为乳腺癌基因治疗提供了新的靶点并且可作为靶向药物开发的新方向，促进肿瘤精准治疗。并且miR-622 可能负调控EYA1 发挥作用，然而miR-622 调控EYA1 的机制以及上下游通路仍有待进一步探索，为以后有关乳腺癌的实验研究提供了新思路。