不同性状脂肪脱细胞基质的制备及研究进展

胡钰玲 祁佐良

【提要】 近年来，组织工程作为一种新兴的治疗手段在整形和修复重建中的应用越来越受到临床和基础研究的重视。然而，目前常见的支架存在可塑性低或生物相容性差等缺点，寻求一种理想的支架材料仍是目前研究的热点和难点。脂肪组织脱细胞外基质（Decellularized adipose tissue，DAT）是指脂肪组织通过一系列脱细胞处理后得到的无细胞提取物，可模拟天然脂肪细胞外基质的特性，具有良好的生物相容性及可调节性，有望作为新型的组织工程支架应用于整形和修复重建等领域。本文将从DAT 的特点、不同性状脱细胞基质的制备方法及研究进展等方面进行综述。

支架作为组织工程最主要的组成之一，不仅可以为细胞和生长因子提供载体，还可以对细胞的黏附、增殖、分化等起到重要的调节作用。目前，应用广泛的支架主要分为两类，一是人工合成的高分子支架，如聚乳酸及聚乳酸聚乙醇酸共聚物等；二是天然的生物类支架，如透明质酸、胶原蛋白[1]、壳聚糖等[2]。前者生物相容性差，降解产物易使人体产生炎症反应，进而导致纤维包裹或表面皮肤溃疡等不良后果，且合成的高分子支架制备工艺复杂，需通过交联等手段添加生长因子或蛋白质以进一步实现生物功能。后者虽有着良好的生物相容性和可降解性，但机械性能差且难以进一步通过化学手段改性。因此，寻找一种新型组织工程支架是目前相关研究的热点和难点。脂肪组织脱细胞外基质（Decellularized adipose tissue，DAT）作为天然的组织成分，被认为有着良好的生化特性，是新型生物支架的理想材料。本文聚焦于DAT 近几年来的研究，对DAT 的特点和不同性状脱细胞基质的制备方法及研究进展等进行综述。

1 脂肪脱细胞基质的特点

脂肪组织作为人体重要的构成部分，在人体广泛分布，来源丰富，获取方便，临床上吸脂手术后丢弃的脂肪组织更是脂肪脱细胞基质的丰富来源。脂肪组织在经过反复的物理、化学或酶处理后，可有效去除含免疫原性的细胞成分，故具有较好的生物相容性，即使异体移植也几乎不会产生组织排斥和过敏反应[3-4]。此外，DAT 支架保留了细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）所拥有的天然结构及胶原蛋白、层粘连蛋白和生长因子等重要生物活性成分，相较于其他合成的高分子支架，更能模拟天然的组织微环境，且无需人为添加外源性生长因子[5]。已有研究表明，DAT 不仅可以为细胞生长提供良好的支持结构和空间，还可以通过黏附、招募宿主的干细胞促进脂肪和血管生成，相较于单纯的脂肪组织移植，混合应用同种异体脂肪的基质进行软组织重建可以获得更好的体积保留率[3，6-8]。同时，DAT 支架适应力和可调节性极强，可以被制备成粉末、水凝胶、薄片等不同的物理形态和体积，或通过特殊手段改变其生物或物理性状，从而满足临床的多种需求，是一种极具潜力的组织工程支架。

2 脱细胞基质的制备

ECM 作为脂肪组织的重要结构，具有良好的孔隙结构，且对细胞行为的调节具有关键作用[9-10]。理想的脱细胞技术是指在脂肪ECM 的基础上进一步去除所有细胞成分，在减少机体免疫排斥反应的同时保留原始ECM 的结构和组成完好无损。目前常用的脱细胞基质的制备方法包括以下几类。

2.1 物理法

脂肪组织通过反复的冻融循环、高速搅拌、机械切碎或研磨等方法可以有效破坏细胞结构，溶解细胞。在低温中操作有助于保持DAT 支架的生物活性，使之在均质化的同时不会对DAT 的微观结构和天然胶原纤维造成破坏。在制备过程中冷冻的温度、DAT 溶液浓度和研磨时间等，均会对产物的性状产生不同影响。较高的冷冻温度和较低的DAT 浓度可提高支架的孔隙率并降低其黏度，而较低的温度则会使支架产生较小的孔径，这可能与加工过程中形成的冰晶大小有关[11-12]。研究表明，种子细胞的空间分布依赖于支架的孔径大小，孔径大的支架能允许更多的营养物质和氧气通过，细胞黏附力和分化能力通常较好，细胞分布也更为均匀，适合细胞生长的三维支架孔径一般为50～400 μm[13-14]。此外，DAT颗粒的尺寸可以通过增加或减少研磨时间来控制，增加研磨时间往往能获得更小尺寸的DAT 颗粒，而相较于大尺寸的DAT 颗粒，较小尺寸的DAT 颗粒和较高密度的种子细胞被认为更能刺激脂肪细胞的再生[15]。

2.2 化学法

一些低渗或高渗的溶液可以通过其渗透压导致细胞裂解，破坏DNA 和蛋白质之间的相互作用，但难以彻底清楚残余的细胞碎片[16]。为了进一步去除ECM 中的脂质和细胞碎片，通常需用化学洗涤剂进行清洗。这些洗涤剂大致分为离子型洗涤剂和非离子型洗涤剂两类。前者包含月桂酰肌氨酸钠、十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸钠等，具有破坏蛋白质和蛋白质之间相互作用的能力，可用来进一步破坏细胞膜，但可能会产生蛋白质变性等不良结果，且后期难以彻底去除[5]。后者主要是指Triton X-100，是组织去细胞化中应用最广泛的非离子洗涤剂，可以干扰脂质和蛋白质之间的相互作用，去除残留的脂质，对组织影响温和，有助于保持组织的原始结构和组成完整[17-18]。然而，再温和的洗涤剂成分也不可避免地会对基质成分产生破坏，特别是十二烷基硫酸钠已被证明可以与ECM 相互作用，改变其结构并显著影响细胞的活性[19-20]。Morissette 等[11]于2018 年首创了一种无洗涤剂的脱细胞方式，既保持了脂肪ECM 的复杂结构和组成，又避免了残留洗涤剂的相关细胞毒性，并能以冻干形式长期储存。此外，应用异丙醇、乙醇、磷酸三丁酯或酸碱等有机溶剂进行极性萃取，也可以进一步溶解细胞的细胞质成分，去除多余脂质[8，18，21]。

2.3 生物酶消化法

目前常用的消化酶有脂肪酶、蛋白水解酶、核酸酶等。脂肪酶可用于去除DAT 中的残留脂质，但效率不及异丙醇[17，22]。胰蛋白酶作为最常用的蛋白水解酶通常与螯合剂乙二胺四乙酸合用，以进一步分解细胞膜蛋白[23]。胰蛋白酶的特异性高，易被血清中和，长时间孵育能更有效去除细胞成分，不易造成残留，但也会在一定程度上破坏ECM，故需严格控制其作用时间[24]。核酸酶，如脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶，则能作用于磷酸二酯键，水解细胞中的核苷酸，达到降低产物免疫原性的作用，在去细胞化的过程中被常规使用[25-26]。

目前所报道的脱细胞方案均步骤繁琐，且差异巨大。不同的去细胞方案可以显著影响脱细胞基质的结构和生化特性，如何简化脱细胞方案并有目的性地控制DAT 的性能，使其能特异性地应用于临床，仍是目前亟需解决的难题和挑战。

3 不同性状脂肪脱细胞基质的研究进展

3.1 粉末状/颗粒状

Choi 等[27]将组织经均质化、离心、冷冻干燥、研磨等操作后制备得到粉末状DAT。粉末状DAT 可作为可注射支架通过细针注射，减少了侵入性外科手术的需求，以最大限度地减少患者在进行软组织缺损治疗时产生的不适和感染、瘢痕形成等不良风险，减轻患者的经济和精神负担。其特殊的疏松质地和多孔结构极大增加了支架的表面积，有利于脂肪干细胞的黏附和生长。将脂肪干细胞接种在粉末状DAT 上注射入裸鼠体内8 周后，可观察到周围血管生成及细胞内的脂滴聚集，且支架无明显吸收，证实了粉末状DAT 在体内能成功构建出成熟的脂肪组织[28]。

3.2 片状/泡沫状

与粉末状/颗粒状不同，片状/泡沫状DAT 是具有二维或三维立体结构的支架。将DAT 浇铸在表面模具中冷冻干燥即可得到片状DAT[29]。该支架能与人成纤维细胞、平滑肌细胞、软骨细胞、脐静脉内皮细胞和脂肪干细胞成功整合，有望用于局部组织缺陷或损伤的治疗[30]。Lee 等[31]使用DAT 片作为敷料，治疗大鼠背部的全层皮肤伤口，结果显示伤口愈合率、上皮形成率和微血管密度均显著高于普通伤口敷料。由壳聚糖膜和DAT 薄片组成的双层复合敷料不但可以诱导肉芽组织和表皮的再生，减少瘢痕形成，并具有优异的抗菌能力[32]。此外，Dunne 等[33]利用圆片状DAT 在体外建立了3D 环境下的乳腺癌细胞模型，为研究乳腺癌细胞的生长、迁移/侵袭、形态和药物反应提供了更好的仿生环境。与片状支架相比，泡沫状支架更侧重于提供一种三维结构。Yu 等[12]使用α淀粉酶酶酶解DAT，并通过冷冻干燥后在模具内溶解的技术和电喷雾两种方式来制备疏松多孔的DAT 泡沫，作为软组织再生和伤口愈合的生物支架。得益于特殊的3D 结构，DAT泡沫可以支持宿主细胞的快速浸润，加快支架重塑和再吸收，使支架能更好地整合到宿主组织中，达到促进血管和脂肪生成的目的。泡沫状DAT 的适应性强，可以根据所选的特定模具制造成各种几何形状。相较于原始的DAT，高度加工后的DAT 泡沫可以更有效地诱导体内的血管生成，但同时加快了其再宿主体内的降解速率，12 周便可被完全吸收[34]。

3.3 水凝胶

水凝胶具有高度多孔的结构和可调节性，在软组织工程化构建中备受关注，粉末状或颗粒状的DAT 可经胃蛋白酶消化，或进一步与聚合物载体结合形成可注射的复合凝胶[35-36]。在小鼠体内注射DAT 水凝胶后，无论是否种植了脂肪干细胞，自第2 周开始都可以观察到脂肪生成的趋势，且随着时间的推移，该趋势更加明显[10]。研究发现，DAT 中所含的Ⅰ型胶原蛋白在合适的pH 和温度下可以聚合形成水凝胶网，寡聚氨酯的加入可以适当地诱导这种聚合，提高植入物的体积保留率，保持细胞活力并阻止成纤维细胞诱导的收缩[37]。Tan等[38]发现，与聚N-异丙基丙烯酰胺混合制备的水凝胶具有热敏性，可在体温下自组装。Jeon 等[39]进一步证明了将聚N-异丙基丙烯酰胺和贻贝黏合蛋白掺入DAT 水凝胶中，可以靶向地向组织缺损部位递送包封的干细胞，达到长期促进血管形成和脂肪诱导的作用。此外，DAT 水凝胶还可通过注射，用于增强瘫痪声带的声功能[40]，或显著增强股骨缺损小鼠的体内骨再生[41]。

4 结论与展望

近年来，天然衍生的生物材料在一系列组织工程应用中均显示出巨大的前景。对于整形和修复重建等领域而言，一种可定向设计性状的工程化的软组织替代物具有重要价值。研究表明，软组织填充物的机械性能尤为重要，显著影响种子细胞的生物学反应[42]。在理想状态下，软组织填充物应该柔韧、富有弹性，能模拟周围的天然组织，以最大限度地适应机体环境，减少炎症和瘢痕形成。

去细胞化的脂肪组织具有保存完好的三维结构和机械性能，与天然组织具有高度相似性，生物相容性好，能为脂肪干细胞的脂肪性分化提供良好微环境，在组织工程及大体积的软组织重建中有着极大的应用潜力。基因和蛋白质研究表明，DAT 可以增强PPARγ 和CEBPα 等脂肪生成的主要调控基因和蛋白质标志物的表达，而无需额外添加外源性因子[23]。同时，DAT 所含的一些天然组分，如层粘连蛋白和纤连蛋白等，也早已被证实在器官发生和伤口愈合过程中起着至关重要的作用，为软组织缺陷、皮肤伤口愈合、骨骼缺损等多种临床疾病的治疗提供了新的思路。除了在体内临床应用外，DAT 在体外研究中也有潜在的用途。DAT 的仿生特性使其能够非常接近地模拟体内微环境，是一种理想的三维细胞培养系统，可用于干细胞的体外培养，为生理学和疾病的研究提供支持。此外，DAT 支架具有强大的适应性和可调控性，除了其本身固有的生化组成和结构外，将原始DAT 进一步交联聚合不仅可以调控支架的降解速率，还可以使其获得更优良的力学特性和生物学特性，降低免疫反应，提高对酶的抵抗性，更好地模拟天然脂肪组织[7，43-45]。生物材料的特性对脂肪组织工程至关重要，如何有目的性地选择交联剂以优化DAT，以及改性后的DAT 支架在体内是否具备稳定性和安全性，仍需进一步研究。近年来，3D 打印技术的出现使DAT 支架的三维结构更加多样化。Pati 等[46]开发了一种基于DAT 的新型生物墨水，可将种子细胞预先封装于其中，用于在体外打印出具有脂肪生成或软骨生成潜力的组织类似物。与3D打印技术联合应用可以有目的地操控DAT 支架，使之具有特定形状和结构，从而促进特定组织类型的形成，也可用于制作高保真的体外模型，用于细胞生物学、人体生理学或疾病病理学的研究。

目前所报道的这些脱细胞方案仍不成熟，操作流程繁琐，成本高产量低，且制备过程中不可避免地需要用到一些对机体有刺激性的溶液，无法大规模应用于工业化生产和临床。如何优化脱细胞策略，使其能在最短的处理时间内最大程度地减少ECM 的宏观变化，确保支架的长期稳定性和低免疫原性，是现阶段研究的一大难点。另外，不同报道所采用的脱细胞方式均有不同，导致制备的DAT 组分及性状也差异巨大。要实现DAT 工业化生产和大规模临床应用，当务之急是标准化脱细胞化流程，建立DAT 的规范化评价标准。若能克服上述难点与挑战，在未来我们有望根据宿主组织特定的物理和生化特性设计出特异性的DAT 支架，为整形和修复重建领域的发展开辟新的途径。