巨噬细胞介导的炎症反应在材料生物相容性评价中的意义

李士杰 姜爱莉 刘宇 王召旭 韩倩倩

【提要】 随着材料科学与免疫学的快速发展，越来越多的生物材料被应用于再生医学领域。材料植入组织后引起的炎症反应与异物反应，是组织修复与再生的障碍，也是开展产品生物相容性评价的重要内容。炎症反应的强度及持续时间直接影响生物材料的组织相容性和有效性，巨噬细胞是主导炎症反应与纤维化的关键免疫细胞，巨噬细胞的数量与行为能够反映出材料是否具有较好的生物相容性。现阶段许多研究以调节、诱导巨噬细胞为目标进行生物材料的改造。因此，生物材料相容性评价也应当重点关注巨噬细胞，以优化、改进现有的生物学评价方法，提高生物相容性评价水平。本文主要综述了生物材料相容性评价的进展和生物材料与巨噬细胞的相互作用，重点阐明巨噬细胞在组织修复与异物反应中的“双刃剑”作用，旨在为生物材料评价的相关研究提供优化评价方法、创新评价思路以及相关的理论依据，以推进医疗器械行业的发展。

生物材料已越来越广泛地应用于组织修复、器官矫正等医学领域，良好的生物相容性是医疗器械临床安全有效应用的先决条件;但材料的生物相容性好与不好并不是一个绝对的结果，免疫反应程度对植入材料也有一定影响，需要依据材料自身性能与实际临床应用进行综合判断，而对材料生物相容性的判定一直是一个复杂的问题[1]。2015 年，国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会共同发布了GB/T16886《医疗器械生物学评价》标准，包括遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验，与血液相互作用实验选择，植入后局部反应试验，刺激与迟发型超敏反应试验，体外细胞毒性试验，材料物理化学、形态学和表面特性表征等共20 部分。基于评价标准与现阶段材料生物相容性评价经验，体内植入试验仍然是最重要的标准方法。将相同的生物材料植入体内不同组织或器官会引发不同强度的炎症反应[2]。因此，我们不仅要从组织、细胞等宏观角度去看待生物材料对系统和细胞的影响变化，更要深入到分子水平，从细胞因子、mRNA 以及基因调控的角度，多方位评价材料的相容性，建立适合我国现状的生物学评价方法，提高生物相容性评价水平，推进医疗器械行业的发展。

理论上来说，生物材料的相容性评价应当贯穿整个材料研发、生产过程，原材料选择、改造方法和加工助剂需要严格的质量控制，但通常生物材料研发与制造企业没有完善的评价体系与设施，所以目前我国以生物材料终产品评价为主。生物相容性评价需要了解产品的原材料与添加的化学成分、是否可降解、是否含有杂质等基本信息，在此基础上的评价结果才更加真实可靠[3]。

炎症反应是生物材料植入后最可能引发的体内生物学反应，材料的构象、大小、数量、表面分子与化学特性都会改变或者调节炎症反应强度。生物相容性差的材料引起过度炎症反应，长期的炎症会导致组织受损，在材料周围形成较厚的纤维包囊，使材料与组织分离，无法发挥功能，最终导致植入失败[4]。早期的研究中追求不引起炎症反应的理想惰性材料，但后续研究指出巨噬细胞介导的炎症反应是生物材料在组织中适当整合并发挥功能所必需的[1，5]，巨噬细胞介导的炎症反应能够保持组织稳态、促进创伤修复，还与异物反应有关。近20 年来，巨噬细胞对组织修复与再生的重要功能得到了医学和生命科学领域的广泛认可[4]，对生物材料的修饰改造从规避免疫反应逐渐转变为适应可调节的免疫反应。越来越多的免疫调节生物材料通过调控巨噬细胞的表型极化，来促进组织重塑、提高材料的生物相容性[1]。例如：从对材料形态的改造来看，Veiseh 等[6]指出球状材料与其他形状材料相比，可以显著减少巨噬细胞的黏附并且降低纤维化程度；从表面特性来看，Getts 等[7]发现表面带负电荷的材料能够增强巨噬细胞的吞噬能力，并促进单核细胞与巨噬细胞的凋亡，减少材料周围巨噬细胞的聚集数量，也相对减少了异物巨细胞（FBGC）的数量。因此，认识巨噬细胞与生物材料之间的相互作用是研究积极有效生物材料的理论基础，也是丰富生物相容性评价科学依据的重要内容。

1 材料植入后引起的异物反应

生物材料引起不可避免的异物反应与组织损伤早已被广泛报道，异物反应是临床上无菌性炎症、外周组织粘连以及纤维化的主要原因[1]，严重阻碍了材料与组织整合的速度和质量。因异物反应导致的植入材料失效、组织坏死或其他疾病给全球造成了极大的经济损失，是生物材料领域研发与评价亟待解决的生物相容性难题。异物反应主要由非特异性免疫系统驱动，单核细胞与巨噬细胞为主要参与群体[8]，循环单核细胞浸润后与材料相互作用，在细胞因子等生化信号的诱导下极化为巨噬细胞。生物材料植入巨噬细胞敲除的小鼠中完全不会引起异物反应[9]。同样，使用药物诱导巨噬细胞缺失也可有效抑制生物材料周围单核细胞浸润、异物巨细胞形成和纤维化[10]。巨噬细胞凭借其广泛的功能与表型，在异物反应中发挥关键作用。调节、稳定两种极化状态巨噬细胞之间的平衡，被认为是调节异物反应的突破点[11]。

对生物材料自身而言，胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、藻酸盐等与天然组织结构相似的材料，能够降低异物反应并在生物体内降解[12]，植入物的表面粗糙度也会影响异物反应[13]。研究，材料的表面化学可影响吸附在材料表面蛋白质的数量、种类与构象，并会影响细胞黏附、扩散和增殖[14]。因此，选择与天然组织结构相似的生物材料并对其改性，能够最大限度降低异物反应。Man 等[15]运用壳聚糖水凝胶-脱矿质骨基质混合支架移植同种异体软骨细胞来修复兔软骨损伤，使用壳聚糖水凝胶填充脱矿质骨基质的大孔，改善支架中种子细胞的分布，同种异体软骨细胞移植24 周后未观察到明显的炎症反应。生物材料植入后造成组织水肿与出血，血液中的各种蛋白被吸附到材料表面。Rostam 等[16]发现，较厚的蛋白质层可能与M1 型巨噬细胞有关，通过降低蛋白质的黏附能够减少巨噬细胞附着，并促进M2 型巨噬细胞极化。现代临床医学中的许多程序依赖于使用电子植入物来治疗创伤性损伤的病症。Kang 等[17]研发了一种生物可吸收的硅电子传感器，硅是一种生物可降解无机材料，所有的植入材料都可以通过水解或代谢作用被自然吸收，并且可以调节元件与封装材料的厚度来控制其在生物体内的持续时间，传感器及其在颅内空间溶解的副产物是生物相容的，通过应用终产物生物相容性好的材料与精确的设备生命周期调控，能够极大地降低异物反应。这种可降解吸收类生物材料为有效避免异物反应提供了非常具有吸引力的材料改造思路，但其与免疫细胞的相互作用需要更加深入的研究，对生物材料相容性的评价需要精确、适合的评价方法。

2 巨噬细胞在炎症反应中的作用

生物材料植入组织后诱发炎症反应，最先到达创伤部位的是中性粒细胞，释放多种细胞因子与多种趋化因子招募血液中的循环单核细胞，并分化成巨噬细胞[8，18]，随后巨噬细胞将诱导中性粒细胞凋亡并吞噬死亡细胞与坏死组织，在后续的炎症反应中占据主导地位。巨噬细胞对组织微环境非常敏感，并具有极高的可塑性，可依据不同信号刺激极化为不同表型发挥不同功能[19]。材料植入初期，巨噬细胞通常在IFNγ、LPS 或TNF-α 的刺激下极化为M1 型（促炎型）巨噬细胞，分泌IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α 等多种促炎细胞因子；在IL-10 或IL-4 的诱导下巨噬细胞可极化为M2 型（抗炎型），分 泌IL-10、TGF-β等多种抗炎细胞因子和PDGF、EGF、VEGF 等多种生长因子，促进组织修复与再生[20]。大量报道指出，M1 型巨噬细胞数量与炎症疾病的治愈程度呈正相关，而M2 型巨噬细胞数量则呈负相关，或两种极化状态的细胞比例对炎症的消退具有很大影响[21-22]。与细菌、病毒性炎症不同，生物材料植入后同样招募大量巨噬细胞，巨噬细胞黏附于材料表面并分泌纤维蛋白基质，试图对材料进行吞噬或降解。但通常材料不能降解或降解缓慢，这使得巨噬细胞不能发挥其强大的吞噬功能而受到“挫败”，进而融合成为体积更大的异物巨细胞，企图通过释放活性氧（ROS）与降解酶将植入组织的材料降解，这一行为被称为受阻吞噬作用[1]。对生物材料植入引起的炎症反应而言，M1 型巨噬细胞数量过多会引起过度炎症，导致组织受损；M2 型巨噬细胞数量过多会在材料周围形成较厚的纤维包囊，导致材料植入失败，但M1 和M2 型巨噬细胞在炎症消退与材料整合方面发挥着不同但同样重要的作用。因此，生物材料植入体内后能否正常发挥预期功能很大程度上取决于免疫反应，稳定M1 与M2 型巨噬细胞数量及选择性抑制的调控策略成为提高生物材料相容性的关键。

活化的巨噬细胞可以招募并诱导纤维细胞转化为成纤维细胞，促进组织修复与纤维化[23]。成纤维细胞在生物材料植入部位增殖，产生大量细胞外基质与高水平的基质金属蛋白酶（MMP）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等多种促生长因子以替换或重塑受损组织[24]。M2型巨噬细胞分泌的IL-4、IL-13 等抗炎因子可以促进成纤维细胞分化，相反M1 型巨噬细胞分泌的IFN-γ、TNF-α 可以抑制成纤维细胞分化[25]，因此，巨噬细胞极化表型在一定程度上决定了生物材料周围主要浸润细胞群体类型。在炎症反应后期，由以产生IL-10 和TGF-β 为标志的M2 型巨噬细胞主导修复阶段，成纤维细胞可与这些抗炎因子产生反应从而促进修复作用[26]。有报道指出，M2 型巨噬细胞中的SMAD3 信号转导可将巨噬细胞转化为成纤维细胞[27]；也有研究推测，一定条件下成纤维细胞也可以转化为巨噬细胞[25]，但该假设目前没有文献证据支持。相似的，巨噬细胞与其他免疫细胞也存在相互作用，并主导炎症反应的发展方向。

3 细胞-材料复合物与免疫细胞的相互作用

组织工程中常以支架材料作为种子细胞或其他生物活性物质的承载媒介，为组织损伤与重建开辟了广阔的前景。对于此类支架材料，不仅需要符合生物相容性评价标准，还要具有良好的细胞亲和性与生物可降解性[28]。目前有大量研究应用支架材料模拟出细胞分化增殖所需的仿生微环境，促进种子细胞的生长发育，使其分泌细胞外基质或胶原蛋白完成组织修复[29]。Wang 等[30]将BMSC 与新型3D 水源性丝素蛋白支架结合，并验证了其在组织工程中的实用性，间充质干细胞能够在这种支架中成功地黏附、增殖和分化，3 周后构建体内部具有足够的ECM 积累，这对于获得稳定的机械性能是必需的。该研究证明了支架材料作为种子细胞载体的广阔应用前景；另外，Wang 等[31]在胶原材料支架上搭载重组骨膜素蛋白促进内源性肌腱干/祖细胞的募集，完成肌腱的再生与修复，并且再生的肌腱显示出机械性能和运动功能的恢复。目前，组织工程中常用的支架材料是天然来源的高分子材料，如胶原蛋白、明胶、丝素蛋白、壳聚糖、海藻酸盐等，这些材料具有较好的生物相容性与细胞亲和性，但其力学性能与可调控降解性较聚氨酯、聚酯纤维、聚乳酸等合成高分子材料差[32]。Hong 等[33]将胶原包被聚乳酸（PLA）微载体与交联壳聚糖水凝胶相结合，设计并制备了一种新型可注射支架结构，该结构同时具有胶原的良好生物相容性与聚乳酸的优异机械性能。

针对支架材料的研究，往往聚焦于支架材料与种子细胞间的相互作用上，而忽略了支架材料植入体内后与机体免疫系统的相互作用。Kudva 等[34]使用明胶微球作为释放TGF-β1的载体以促使软骨再生，但动物体内非常多的细胞具有TGF-β 受体，如巨噬细胞、成纤维细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞[35]，TGF-β 的释放可能会抑制免疫活性细胞的增殖，抑制PBMC 中IFN-γ 和TNF-α 的产生或促进成纤维细胞、成骨细胞和施万细胞的生长。因此，细胞-支架复合物或生物活性分子-支架复合物的生物相容性评价，必须要考虑到种子细胞或因子与宿主免疫系统的相互作用。巨噬细胞介导的吞噬或降解作用是否会对种子细胞或支架材料自身造成影响，从而导致植入修复失败；支架材料植入后M1 型巨噬细胞介导的强烈炎症反应，是否会对种子细胞生长发育环境造成影响，这些问题现在仍然没有确切的答案，同时也没有针对性的生物学评价方法，成为了植入手术失败或引起其他疾病的安全隐患。因此，我们在进行细胞-材料复合物等类似材料评价时，应当聚焦宿主免疫细胞的动态行为，以材料植入后炎症发展进程为指导，负反馈于支架材料与种子细胞设计，使其更好地服务于组织工程与再生医学。

4 巨噬细胞动态表征是评价生物材料植入后炎症反应的重要指标

在生物材料植入的背景下，对巨噬细胞的动态行为进行表征作为材料整合和组织再生的指标[36]。早期生物材料的大部分研究都是通过体外试验进行的，随着分子克隆技术的发展，各种模式动物以及动物模型逐渐建立，使我们对材料与免疫系统的相互作用有了更加深刻的了解。现阶段评价使用的动物模型以鼠类为主，虽然小鼠与人类免疫细胞亚群具有高度同源性，但也有大量报道指出两个物种之间存在免疫学差异[37-38]，也有研究提出使用人源化小鼠模型进行生物材料免疫反应评价[39]，这些免疫学差异是否会导致在小鼠体内模拟的生物相容性评价不能完全适用于人类？这仍需要我们进一步研究证实。另外，Hachim 等[40]报道生物材料植入年轻与年老的小鼠中引起的免疫反应有差异，包括巨噬细胞的募集、标志物表达、细胞极化均存在不同；也有研究指出新生儿与成年人相比具有独特的巨噬细胞极化表型，不适用于M1与M2 型分类[41]。由此可见，对于生物材料相容性评价不仅要评估材料本身是否满足安全有效性，也需要依据材料受众的个体差异设计更加完善、适用的评价方法。

在体内复杂的微环境中，M1 型与M2 型巨噬细胞并不代表所有巨噬细胞的极化状态，除此之外还有未完全极化的M1 样与M2 样巨噬细胞、共表达M1 与M2 型标志物的巨噬细胞，M1 与M2 可以被看作两种功能表型的极端状态且在特定条件下可以复极化[42-44]。因此，我们可能需要依据巨噬细胞的标志物、分泌的细胞因子及基因表达水平，对巨噬细胞进行更加准确的分类并判定功能状态，更好地探索巨噬细胞与生物材料在体内的相互作用。现在对生物材料的改造都以调节巨噬细胞极化方向为目标，比如通过细胞因子诱导巨噬细胞极化为抗炎表型、通过改变生物材料的物理化学性质进行调节，还有脱细胞基质、炎性介质顺序递送等方法[45]。由Dai等[46]研究制备的BaTiO3/P（VDF-TrFE）铁电纳米复合膜材料能构建仿生电学微环境，对材料进行电晕计划处理后，铁电纳米复合膜产生剩余极化，形成的表面电势能够改善局部免疫微环境，诱导巨噬细胞表型由M1 型向M2 型转化，并可抑制IL-6、TNF-α 等促炎细胞因子的表达，明显提高修复效果。Yang 等[47]通过自主开发的脂质体表面修饰技术，在电纺纤维表面上建立了细胞膜仿生涂层，通过表面修饰降低了植入后的炎症反应程度，促进巨噬细胞向M2 型极化，并能降低异物反应，促进细胞浸润。这些材料改造方式都是通过调节免疫微环境来诱导巨噬细胞向M2 型方向极化，但免疫调节因子的释放时间与浓度需要精确控制，存在破坏局部组织稳态的风险。因此，对创新型生物材料的评价需要依托巨噬细胞的动态行为，建立起适合免疫调节类材料生物相容性的评价方法。生物材料介导的巨噬细胞极化免疫调节是未来组织工程材料设计的一个有希望的方向[48]，同样，以巨噬细胞为媒介进行材料生物相容性评价也一定是一个充满希望的方向。

5 讨论与展望

综上所述，生物材料植入后引起的免疫反应亦正亦邪，有利的免疫反应能够促进创伤愈合、组织修复与再生，使材料发挥理想作用；不利的免疫反应会引起慢性炎症、形成纤维包囊，导致植入失败或组织坏死。这些“利弊”的形成与调控关键在于巨噬细胞[49]，尽管中性粒细胞、树突状细胞、T 细胞等多种免疫细胞参与生物材料植入后的炎症反应，但巨噬细胞在材料整合、组织修复以及纤维化中的作用是至关重要且不可或缺的。目前，对生物材料植入过程中调节巨噬细胞功能的确切机制尚不完全清楚，但它们在修复和再生过程中的关键作用，使它们成为设计组织愈合与再生策略时的主要目标。同样，生物材料相容性评价也应当聚焦巨噬细胞的数量与行为，通过表征、成像或三维重建等前沿科技手段量化炎症反应强度。随着材料学、免疫学与分子生物学的交叉融合，我们能够建立更便捷、更精确的评价方法，对材料生物相容性的评价应当深入到细胞水平、分子水平乃至基因水平。

对于医疗器械检定行业而言，苏木精-伊红（HE）染色与免疫组化等传统病理分析方法虽然能满足检测产品生物相容性的需要，但因其试验周期长、非特异性染色不能有效解决、结果判定缺乏客观性等局限性，使得部分医用生物材料植入人体仍然具有一定风险，可能导致长期炎症、组织坏死甚至癌症。随着医疗器械行业的发展，通过新技术、新理念、新方法研究出来的生物材料屡见不鲜，但现行评价标准规范中的实验方法已不能满足对新型生物材料全面、科学评价的需求，尤其是需要长期甚至终生与人体相接触的材料和具有组织诱导、免疫调节功能的生物材料，其潜在的生物安全风险需要更加全面的评价。近几年模式动物与小动物成像逐渐成为相关研究中的常用的实验方法，今后或许可以将模式动物与生物相容性评价结合起来，将活体成像与巨噬细胞结合起来，将巨噬细胞数量、极化状态与炎症反应强度结合起来，以巨噬细胞为媒介建立起更加全面、客观、准确、高效的生物相容性评价方法。