松墨天牛肠道微生物研究进展

时增增， 吴岩镇， 林志艺*

(1.福建农林大学林学院/生态公益林重大有害生物防控福建省高校重点实验室，福州 350002；2.福建省福州市连江县林业局，福州 350100)

1 引 言

松墨天牛(MonochamusalternatusHope)是一种树干侵入性甲虫，是松材线虫病的主要传播媒介，在我国南方多个省市都有分布[1]。松材线虫病是我国的一种重要的林业检疫性病害，该病自传入我国以来，对我国林业系统已经造成了重大的危害，所以又被称为松树的“癌症”。松墨天牛对松树的取食不会造成松树的大量死亡，但它所携带的大量的松材线虫分泌的化学物质对松树有致命的伤害[2]。目前对松墨天牛的防治追求物理、化学、生物相结合的综合防治。在物理防治上，主要采用去除疫木、切断传染源等措施；在化学防治上，主要是利用注干剂、无人机进行药物的输入[3]。生物防治主要是开发生物毒素、天敌等进行天牛种群的控制。

肠道微生物是指生活在宿主肠段内微生物的总称，不同昆虫体内肠道微生物具有不同的种群规模[4]。肠道微生物在宿主新陈代谢、生长发育等多方面发挥着重要作用。许多研究表明蛀干害虫肠道拥有丰富微生物种群，其数量比昆虫自身细胞的总数还多[5-6]。随着16S rDNA基因测序、宏基因组学和蛋白质组学分析技术的运用更进一步的扩宽了人们探究肠道微生物的视野[7]

2 松墨天牛肠道菌群的特征

2.1 松墨天牛肠道微生物群落组成

松墨天牛肠道微生物占主要地位的是细菌。胡霞等人发现我国室外松墨天牛幼虫的肠道优势菌是变形菌门(Proteobacteria)[8]。陈宏建等人运用16S rDNA 的高通量测序技术发现在门的水平上，无论是在野生还是饲养条件下，松墨天牛肠道菌群的优势门均为变形菌门和厚壁菌门(Firmicutes)。且在室内人工饲养的情况下，变形菌门占有更大的丰度。这与胡霞等人的研究一致，说明国内野外条件下松墨天牛肠道的优势菌群相对稳定。通过对OTUs 组成和 Alpha 多样性的分析表明，室内饲养的松墨天牛成虫具有更多的肠道菌群[9]。在属水平上，国内的松墨天牛成虫肠道中占据主要地位的是肠杆菌属(Enterobacter)。在国外的研究中，克吕沃尔菌属(Kluyvera)是主要的室外成虫肠道菌群，沙雷氏菌、肠杆菌属、无色杆菌属(Achromobacter)和红球菌属(Rhodococcus)是主要室内种群的肠道菌群，结果与国内存在差异，这与国内外松墨天牛生活环境不同有关[10]。

2.2 松墨天牛肠道微生物群落结构特征

昆虫的肠道分为前肠、中肠和后肠，不同位置的肠道担任的生理功能不同，随着不同肠段担任的主要功能不同，其所富集的微生物的种群与丰度也有差异[11]。陈宏建等人利用Illumina HiSeq技术对松墨天牛幼虫肠道细菌的16S rDNA V3-V4区序列进行文库构建和高通量测序后发现，在OTUs水平上，前肠OTUs最少,后肠OTUs最多[12]。这表明，在松墨天牛的肠道中，菌落最丰富的是后肠，这也说明了在松墨天牛中后肠是主要的消化肠段。在松墨天牛幼虫的5个龄期中，肠道微生物在门的水平上是相似的，但前2个龄期的细菌种多样性显著高于后面的龄期，这与松墨天牛前期生活在具韧皮部与木质部的交接层，后期生活在营养物质单一的木质部是分不开的。

2.3 松墨天牛肠道菌群的变化规律

松墨天牛是完全变态类昆虫，生活周期包括卵、幼虫、蛹、成虫4个时期。综合国内外对松墨天牛幼虫与成虫的研究，幼虫与成虫的优势菌在门的水平上差别不大，在属的水平上主要差异在于次优势菌。在国内松墨天牛幼虫肠道菌群主要是变形菌门，优势菌包含肠杆菌属、葡糖杆菌属(Gluconobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)，这与Kim等[10]发现一致，但不同的是变形菌门所占比不同，并且属的水平上是以布丘氏菌属(Buttiauxella)、红球菌属(Rhodococcus)为主。在松墨天牛的成虫中，国内松墨天牛成虫肠道也是以变形菌门的肠杆菌属为主，而国外松墨天牛成虫肠道中则以克吕沃尔菌属(Kluyvera)为主。

3 松墨天牛肠道微生物的功能

3.1 维持肠道内生态环境的稳态

后生动物肠道里的微生物群落,参与宿主生长、发育、分化和免疫等广泛的生理活动[13]。松墨天牛在取食的过程中，一些微生物会随着食物的进入并定植在其肠道中。这些定植在松墨天牛体内的微生物，部分承担着为松墨天牛降解难以消化的食物；部分则与松墨天牛相互作用调控天牛生长发育[14]。如松墨天牛肠道微生物可以帮助天牛进行糖类和氨基酸的代谢。共生微生物作为天牛的得力助手，不仅能帮助天牛克服木质纤维素、抵御病原菌还具有固氮等功能[15]。这些微生物为松墨天牛提供的便利，让其在竞争与生存方面获得优势。

3.2 促进松墨天牛分解消化

木质纤维素是松墨天牛能主要摄取的营养物质。若要以木质素为营养来源，仅依靠其自身的消化能力是不够的，胡霞等人通过可培养的方法在松墨天牛幼虫肠道中共筛选出能降解木质纤维素的菌株154株，其中丛毛单孢菌(Comamonaskoreensis)和噬纤维细菌(Siphonobacteraquaeclarae)具有较强降解能力[16]。松墨天牛主要以马尾松为食，马尾松含氮量极低，氮素的缺乏对松墨天牛是一种需要突破的挑战。谢谷艾等[17]用Ashby 培养基筛选出9种松墨天牛幼虫肠道中的含有固氮作用的细菌，包括肠杆菌属(EnterobacterHormaecheandEdwards, 1960)、气球菌属 (AerococcusWilliams,HitchandCowan, 1953)、柠檬酸杆菌属(CitrobacterWerkmanandGillen, 1932)、固氮菌属(Azotobacter)等。肠道微生物帮助松墨天牛解决了碳、氮等元素缺乏、难获取等问题，这为松墨天牛在一个地区的生存及繁衍提供了直接的保障。

3.3 抵御病原体

松墨天牛成虫因其具翅能飞、活动能力强，所以能接触到很多微生物，其中能侵入并使其致病的病原菌也有很多。如白僵菌(Beauveria)、苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)、粘质沙雷氏菌(SerratiamarcescensBizio)等。为了增强自身对环境的适应，昆虫肠道进化出了很多防御机制，如双氧化酶 DUOX 介导产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和 Imd 信号通路产生的抗菌肽 (antimicrobial peptides，AMPs)[18]。在 DUOX 途径中，细菌可以分泌激活 DUOX 介导产生 ROS的非肽聚糖配体尿嘧啶[21]。在Imd途径中，宿主体内的微生物可以识别受体和免疫防御机制，这些特异性的微生物受体，是其共生菌在与宿主长期进化过程中的一种保护机制[20]。另外在富集大量细菌的马氏管中，也能产生许多免疫类物质帮助昆虫抵御病原微生物的入侵。

4 展望及总结

随着松墨天牛肠道微生物研究的深入，可以从其肠道内获得启发，实现“以菌治虫”。肠道微生物不仅本身一定的杀虫潜力，其还能产生一些具有杀虫活性的物质，如苏云金芽孢杆菌产生的具有较好杀虫活性的内毒素——伴胞晶体[21]。以“以菌治虫”的灵感主要来自被菌感染的虫子尸体，如吴松青等人分离出的 BRC-CXG2 菌株能产生灵杆菌素，这可以作为Bti LLP29胞晶混合液的增效剂[22]；牟亚妮等人在松墨天牛尸体中分离的铜绿假单胞菌对天牛幼虫具有杀虫活性[23]；运用松墨天牛肠道中的优势菌属作为工程菌，携带Bt Cry3Aa毒素，可以对其产生良好的杀虫效果。在昆虫的肠道中，微生物之间存在着一些巧妙的互作关系。在同为入侵性甲虫的红脂大小蠹中，周等人研究发现小蠹虫幼虫和其伴生真菌对优势糖原的获取存在竞争关系，这会严重影响小蠹虫幼虫的生长发育，但小蠹虫的肠道细菌Serratialiquefa-ciens、Rahnellaaquatilis和Pseudomonas产生的氨气会改变半生真菌的糖原消耗顺序，缓解其对小蠹虫糖原的竞争[24]。这种巧妙的细菌与真菌之间的关系，对幼期的小蠹虫是非常有利的。徐等人发现被清除了肠道细菌的小蠹虫更容易被白僵菌侵染致死，经过实验证明，这其中的关键在于欧文氏菌(Erwinia)的有无[25]。这种利用昆虫肠道内细菌与真菌之间的互利或拮抗关系有助于进一步利用微生物来防治有害昆虫。

综上所述，松墨天牛的肠道微生物种类复杂多样，且在松墨天牛生长发育中发挥着重要的作用。国内不同地区松墨天牛的主要肠道微生物差别不大，但国内与国外松墨天牛肠道里的优势菌群存在较大差异，这跟松墨天牛所取食环境相关。松墨天牛因其主要生活在韧皮部之内，防治困难，因此物理、化学、生物等防治手段相结合才能发挥最大的杀虫效果。在松墨天牛的防控中，可以继续挖掘其肠道微生物的功能，为创造新的工程菌提供参考。