慢性阻塞性肺疾病相关动物模型研究进展

周利润,崔晓兰

(中国中医科学院中药研究所,北京 100700)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种进行性、以持续性呼吸症状和气流受限为特征的慢性呼吸系统疾病,并与气道和肺部对氮氧化物颗粒或有害气体的慢性炎症反应增强有关,慢性气流受限由小气道阻塞、慢性支气管炎和肺实质破坏(肺气肿)共同作用所致,可影响日常活动和总体生活质量[1-2]。在全球范围内受影响人口约3.28亿,且高龄时患病率更高,约10%为中年人、25%是大于70岁的老年人[3]。COPD目前是第三大死亡原因,死亡人数超过300万人/年[4]。由于人口老龄化日益严重以及历史和当前的吸烟率较大,导致COPD的全球死亡率正在逐年上升,并且世界卫生组织预测到2030年COPD的患病率和死亡率将总体上升30%[5-6]。吸烟每年导致约500万例死亡,是COPD发生的主要内在风险因素,但也有其他外部风险因素,包括暴露于烟草烟雾环境下的二级和三级吸烟,以及职业暴露于灰尘、有毒烟雾和蒸汽、燃烧生物燃料造成的室内空气污染和室外空气污染[7-9]。

COPD与破坏肺实质组织有关,破坏正常的修复和防御机制,这种肺损伤导致慢性空气潴留、进行性气流受限和对入侵病原体的易感性增加[10]。研究表明,COPD患者的肺部可能比健康肺部更容易感染更多的致病菌,46% ~ 72%的COPD患者的痰液中发现了细菌,并且大约50%的COPD的恶化由细菌引起,细菌过度生长可能是COPD加重的诱因[1,11]。气道细菌感染使大多数COPD患者的病程复杂化,导致症状加重、肺功能进一步受限、急性发作以及生活质量下降[5]。COPD的急性加重(AECOPD)是指患者咳嗽、咳痰、呼吸困难持续恶化并超出了日常变异范围,随着病情进展而不断加剧,降低了机体的气体交换能力,导致低血氧症、高碳酸血症、肺组织纤维化等,最终发展为肺源性心脏病,导致全身多器官衰竭,最后造成生活质量下降甚至会引起死亡。在疾病进行过程中可能出现发热、炎痛等明显合并加重症状,其主要诱因是细菌病毒感染[12]。细菌病毒感染COPD患者所致AECOPD会使病情进一步加重,临床治疗难度进一步加大,死亡率进一步增加[13]。

本文将分析COPD以及AECOPD动物模型的建立方法,以期为构建适宜稳定的AECOPD动物模型,为深入研究AECOPD的致病机理、耐药菌感染相关机制及开发新的抗AECOPD药物奠定基础。

1 慢性阻塞性肺疾病动物模型建立方法与评价指标

1.1 常见慢性阻塞性肺疾病动物模型

目前COPD动物模型常用的实验动物包括:小鼠、大鼠、豚鼠、果蝇、犬、猪、雪貂、猴等,其中应用最为广泛的为啮齿类动物[14]。

1.1.1 慢性阻塞性肺疾病鼠类模型

鼠类与人有大约90%的相似基因,许多生理通路和过程在临床上是相关的[8]。鼠类品种繁多包括大小鼠、豚鼠、仓鼠、金黄地鼠等[15],繁殖周期短、利于繁殖、饲养简单、成本较低以及目前对鼠类基因组的研究比较透彻[16]。豚鼠的肺部解剖结构类似于人的呼吸道结构,呼吸上皮细胞排列均匀,可建立与人类相似COPD的疾病发作特点[17]。临床上COPD患者多由于吸烟引起的,大小鼠为专属性用鼻呼吸动物,对烟的滤过效率较低,建模方便快捷[18],炎症反应明显,造模稳定性高。某些品种经过基因修饰后对烟雾更为敏感,可用于研究参与COPD病理生理过程性病变的某些特定基因和蛋白的变化[19]。

1.1.2 慢性阻塞性肺疾病小型猪模型

小型猪的肺组织比鼠类动物更为发达,是目前建立COPD模型较为理想的动物,其肺叶明显,左二右三的结构与人类类似,具有呼吸性的细支气管,呼吸道黏膜下腺体较为丰富,容易感染呼吸道的相关疾病,气管较为粗大,易于相关操作和评价,诱导COPD模型相对容易[20-21]。

1.1.3 慢性阻塞性肺疾病果蝇模型

果蝇的呼吸系统与哺乳动物的肺部系统相似,在发育和功能方面有很多相似之处,可以很清晰地观察到气道的早期结构损伤,可以对其所涉及的信号通路和细胞过程进行相关遗传和药理学操作,其可以关联人类疾病基因,可通过果蝇筛选人COPD的相关基因[22]。可以研究气道上皮屏障功能和先天性免疫的异常[23]。

1.1.4 慢性阻塞性肺疾病犬模型

犬极易发生自发性过敏反应,受到刺激后支气管收缩反应的时间过程与患者相似,并且支气管痉挛的程度与刺激的持续时间和强度成正比[24]。人类吸烟是导致COPD的主要原因,犬暴露于香烟烟雾后出现的肺部病变与人类COPD中出现的病变类似[25-26]。目前犬已被广泛用于COPD领域的研究,长期研究显示这些肺功能参数随着时间的推移具有显著的稳定性[27-29]。因此,可以在COPD的慢性犬模型中评估肺功能的变化,包括评估气道高反应性。犬像小型猪一样体型相对较大且易于操作。

1.1.5 慢性阻塞性肺疾病雪貂模型

雪貂作为十分适合研究呼吸系统疾病的动物,有数据表明它们与人类气道生理学和粘膜下腺体的分布十分相似。研究表明将雪貂暴露于香烟烟雾中后,发现它们与人类COPD的复杂临床特征接近,暴露在烟雾中的雪貂表现出较高水平的气道阻塞,伴有杯状细胞化生、增生和小气道粘液表达增加[30],具有明显的慢性支气管炎和肺气肿的特征。

1.1.6 慢性阻塞性肺疾病猴模型

灵长类动物在生理学、遗传学、解剖学、肺部免疫系统等方面都与人有着高度的一致性,猴常被用作实验动物,其中恒河猴具有与人类及其相似的肺部结构,具有二分支的细支气管,肺泡分布广泛,纤毛、杯状细胞排列顺序与人类极为类似,在吸入香烟烟雾后可表现出慢性细支性支气管炎、肺气肿以及其他气道病理学改变,所具备的独特优势用于建立COPD最为合适[31-33]。

1.2 慢性阻塞性肺疾病动物模型常见建立方法

COPD临床发病机制复杂,已有多种建立方法,常见的建模方法为将实验动物暴露于香烟烟雾、脂多糖、蛋白酶、菌毒株以及大气颗粒物等。

1.2.1 香烟诱导

香烟是导致COPD的主要原因,临床上大约有90%的患者由吸烟引起,流行病学研究表明吸烟者比不吸烟者更容易患COPD[34]。香烟烟熏造模的方法主要有两种:(1)直接经鼻烟熏:将烟雾直接输送入动物鼻腔内;(2)全身暴露法:将动物置于连接烟雾发生装置的容器进行全身暴露烟熏。研究表明单纯鼻接触和全身接触烟雾导致肺损伤的机制可能是相同的[35]。香烟烟雾可直接损害气道上皮细胞,使纤毛结构和功能受损,引起支气管平滑肌痉挛收缩和粘液分泌,气道阻力增加,颗粒物会沉积在小气道中,引起慢性炎症反应。这种慢性炎症反应会破坏肺实质、肺泡壁,并永久扩张小气道,从而诱发肺气肿和气道重塑[36]。

单纯的香烟烟熏进行造模,造模时间长、成模慢,持续时间多为4 ~ 6个月甚至更长时间[37],且烟熏过程稳定性不易保证,易出现死亡等不良情况。

1.2.2 弹性蛋白酶诱导

COPD主要临床表现症状为肺气肿,目前蛋白酶作用是肺气肿、急性肺损伤模型建立最常见的方法,蛋白酶—抗蛋白酶失衡也是COPD发病机制最经典的学说,所以蛋白酶(弹性蛋白酶或木瓜蛋白酶或猪胰腺弹性蛋白酶)的气管内滴注也可用于研究COPD的相关症状的近似表现[38]。木瓜蛋白酶是最常用于诱导肺部肺气肿病变的蛋白水解酶。通过接触性给予蛋白酶可诱导单纯性肺部症状外,还有肌肉萎缩、体重减轻以及全身性炎症反应[39]。有研究表明通过气管内滴注蛋白酶会使模型动物肺泡腔扩大、肺水肿、炎症浸润、血氧饱和度下降等症状,与临床症状具有一致性[40]。

此方法相比于香烟烟熏法具有成模时间短、成本较低以及易于操作等优点,气管滴注弹性蛋白酶仅需要21 d即可建立肺气肿模型,用来代替慢性阻塞性肺疾病模型[41]。蛋白酶进行造模虽然具有成模时间短操作方便等优点,但其只能出现部分病理症状改变,与临床COPD发病机制仍有差别。

1.2.3 脂多糖诱导

作为内毒素属的一种重要物质,脂多糖是革兰氏阴性菌的细胞壁成分,能刺激炎性细胞产生并释放炎性介质,产生一系列的炎性反应,引起黏液分泌过多、气道高反应、炎性细胞浸润、肺功能下降、肺气肿、肺部纤维化等COPD典型症状[42]。目前脂多糖常单独气管注射或香烟烟熏联合气管滴注脂多糖来建立COPD动物模型,严重的可出现肺动脉高压等严重症状[43-44]。脂多糖进行造模的缺点与蛋白酶诱导的慢性阻塞性肺疾病模型基本一致。

1.2.4 空气颗粒物诱导

空气中的污染物如PM2.5、SO2、NO2、汽车尾气、臭氧等物质均能对肺部产生不同程度的影响,也是慢性阻塞性肺疾病形成的重要原因。PM2.5可参与慢阻肺、支气管哮喘等多种呼吸系统疾病的发生和发展,研究表明,PM2.5的浓度升高可增加慢阻肺的患病率,并且慢阻肺的死亡率随着其浓度的增加而升高,目前常见的PM2.5造模方法有吸入和做成混悬液滴鼻或者气管滴注进行[45]。SO2是工业烟雾的主要成分,在阻塞性气道疾病的发病机制中起着重要作用。吸入SO2会产生多种病理、炎性以及生理反应,与慢性支气管炎症状相似[46]。同时NO2吸入、香烟尘雾滴鼻、臭氧熏蒸以及汽车尾气的吸入和滴鼻以及与LPS联合应用也曾应用于慢性阻塞性肺疾病的模型建立[47-50]。

1.3 慢性阻塞性肺疾病动物模型常见评价方法

1.3.1 一般体征评价

COPD动物模型建立过程中会出现体重减轻、饮食量减少、饮水量增多的一般表现,还会出现咳嗽、黏液分泌增多、毛色暗淡枯槁无光泽、精神萎靡、运动量下降等表现。有研究表明临床慢性阻塞性肺疾病患者还会出现体重指数下降、皮下脂肪、内部储备脂肪以及白蛋白减少等状况[51]。模型建立动物表现与临床基本一致。

1.3.2 肺功能评价

肺功能检测是COPD患者临床诊断的黄金标准,是检测患者肺容积大小以及是否存在呼吸受限的重要指标,随着技术水平的发展,动物适配的肺功能检测设备应用也越来越广泛。有创无创设备均能实现对于肺功能的检测,有创检测可在麻醉条件下通过呼吸机辅助测量动物每秒用力呼气容积/用力肺活量的比值来表示气道受限情况,与临床基本一致[52]。无创检测可通过相关肺功能仪检测呼吸气峰流速、潮气量、吸气阻力、动态肺顺应性、呼气量、50%呼气峰流速、呼吸频率等相关肺功能指标[53-55]。

1.3.3 病理组织评价

肺部实质性病理变化能直观表现肺组织的病变情况,测定平均线性间隔、平均肺泡数和支气管壁厚/直径比值能较好的表现出肺部病变情况。COPD模型动物会出现肺泡管、肺泡囊和肺泡的明显扩张,肺泡结构紊乱,肺泡壁有变薄和破裂的迹象,有些已经融合成肺大疱。并且出现纤毛细胞变性坏死以及纤毛倒伏、断裂、粘连、脱落等情况,上皮细胞脱落、杯状细胞化生、黏液分泌增多等。肺动脉壁增厚,管腔变窄,有不同程度的外周中性粒细胞、淋巴细胞和单核巨噬细胞浸润[56]。

1.3.4 其他评价

血气分析、血氧饱和度、炎性因子、炎性细胞等也可以用来辅助评价慢性阻性肺疾病模型是否建立成功。如肺组织和肺支气管可出现多种炎性细胞浸润,炎性细胞的浸润聚集也是炎症发展过程中的重要环节;各种细胞因子在慢阻肺初期也会有较大变化,对模型的鉴定和评价也有重要意义;在COPD后期还会出现血氧饱和度下降、低血氧症和高碳酸症等表现,所以在评价慢性阻塞性肺疾病模型时血氧饱和度也是重要的实验指标[57-59]。

2 慢性阻塞性肺疾病急性加重期动物模型建立方法与评价

AECOPD模型的建立在COPD模型建立的基础上进行,所以AECOPD模型建立和COPD模型所用动物相互重合。本段只对AECOPD模型建立方法和评价进行讨论。

2.1 慢性阻塞性肺疾病急性加重期动物模型建立方法

感染是导致COPD急性加重的重要原因,其中细菌感染约占60%,病毒感染占30%左右,其他非典型感染占10%[60-61]。

在AECOPD患者的痰液中分离到的主要细菌株有铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等,分离到的病毒主要有甲型流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等[62-65]。目前临床常见的AECOPD模型的建立均是在COPD模型的基础上进行滴鼻或者气管滴注细菌病毒来诱导。

如祁海燕等[66]采用弹性蛋白酶气管滴注建立肺气肿大鼠模型,COPD模型建立成功后第2天肺气肿大鼠气管内滴注0.15 mL 1 × 1012CFU/mL的肺炎链球菌琼脂悬液,构建AECOPD大鼠模型。Wang等[67]则通过采用气管内注射18单位的猪胰腺弹性蛋白酶建立金黄地鼠肺气肿模型,并在模型建立的基础上右肺内注射含有3 × 108CFU/mL流感嗜血杆菌的琼脂珠100 μL。张甜甜等[68]采用香烟烟熏法建立慢阻肺大鼠模型,模型建立成功后第2天,COPD大鼠气管内滴注0.2 mL浓度为2.4 × 109CFU/mL的肺炎链球菌琼脂悬液或浓度为6 × 108CFU/mL铜绿假单胞菌悬液。Guan等[69]采用香烟烟熏法建立慢阻肺小鼠模型后鼻腔缓慢滴入30 μL 108CFU/mL的流感嗜血杆菌菌液,Roos等[64]则在COPD模型基础上采用 35 μL 106CFU/mL的流感嗜血杆菌菌液建立模型。Xiao等[62]采用香烟烟熏法建立慢阻肺小鼠模型后鼻腔缓慢滴入50μL 2LD50的甲型H1N1流感病毒感染建立模型。

香烟烟雾和细菌、病毒感染对气道损伤有协同作用,这种损伤可能是通过对弹性蛋白酶活性的影响介导的,且感染性物质的入侵会使气道炎症和全身炎症进一步增加。细菌或病毒感染激活相关信号通路,可调控细胞因子和趋化因子的基因表达,进一步促进疾病的发展,COPD咳痰困难粘液分泌过度更易于细菌病毒的定植,且细菌感染相关病理变化与COPD进行和发展也具有高度一致性[62]。

2.2 慢性阻塞性肺疾病急性加重期动物模型评价方法

有研究表明AECOPD动物模型在滴入菌液后会出现活动能力下降、呼吸急促、活动后加剧、出现哮鸣音、咳嗽进一步加重,与临床表现一致[70]。细菌标志物如C反应蛋白、降钙素原等因子的急剧增加,呼吸频率、呼吸气峰流速进一步增加,而潮气量和呼气量均减少,50%呼气峰流速也下降明显[71]。并且可以在肺组织匀浆中培养出相关菌落[72]。

3 小结

临床上吸烟是导致慢性阻塞性肺疾病的主要原因,所以目前最常用的模型为单纯香烟烟熏和烟熏联合气管注射脂多糖来进行造模。但单纯被动吸烟法具有造模时间长、难度大,饲养过程中动物状态不容易保证,烟熏过程中容易死亡等缺点,而被动吸烟联合气管注射脂多糖虽然能很大程度上节省时间但LPS主要是引起急性肺损伤,而临床上COPD患者多由吸烟等颗粒物沉积造成的,不能更好的还原临床,所以急需一种能够更好的还原临床发病机制的动物模型来进行药物筛选和评价实验。目前急性加重期模型建立还处于初期阶段,甚至慢性阻塞性肺疾病还未见统一标准,标准的动物模型的缺失仍然是阻碍COPD、AECOPD研究发展的关键原因之一。