连续流动分析仪测定水溶肥料硝态氮

李亚丽 孔令娥 刘 蜜 汪 洪* 苏志明

(1.中国农业科学院 农业资源与农业区划研究所，北京 100081； 2.国家化肥质量检验检测中心(北京)，北京 100081； 3.农业农村部农产品质量安全肥料源性因子风险评估实验室(北京)，北京 100081； 4.中国合格评定国家认可委员会，北京 100081)

水溶肥料中氮养分形态主要有铵态氮、硝态氮和尿素态氮，养分高、水溶性好，适合现代农业生产，节水、省肥、高效，广泛用于各种粮食、蔬菜、果树等经济作物，发展迅猛，但目前尚未见对水溶肥料中硝态氮含量及其检测方法单独作出规定[1-3]。

目前，肥料中硝态氮的测定方法有重量法、分光光度法、离子色谱法、高效液相色谱法、拉曼光谱法等[4-5]。国家标准《肥料中硝态氮含量的测定氮试剂重量法》(GB/T 3597—2002)规定了肥料中硝态氮含量的测定方法为氮试剂重量法，适用于各种肥料中硝态氮含量的测定，但当9倍于氮含量的过量氯化物存在时，测定结果偏高，且操作步骤烦琐，测试时间长，检验过程中容易引起误差，造成测定结果的重现性较差。农业行业标准《肥料硝态氮、铵态氮、酰胺态氮含量的测定》(NY/T 1116—2014)规定了紫外分光光度法测定肥料中硝态氮含量，适用于硝态氮含量较低的样品，当试样中硝态氮浓度过高时，试样可能因稀释倍数较大，导致测定结果误差偏大。离子色谱法、高效液相色谱法、拉曼光谱法等方法灵敏度高，稳定性好，但成本较高，分离步骤较为复杂，肥料中可能含有的Cl-、SO42-、PO43-等与NO3-共存的阴离子对NO3-产生一定的影响[6]。

连续流动分析仪法是采用空气片段连续流动分析技术，将试样溶液和试剂在一个连续流动的系统中均匀混合[7]，在硫酸铜作催化剂的碱性溶液中，用联氨将硝酸盐还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐与磺胺和对氨基苯磺酰胺及 N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(C10H7NH2CHCH2NH2·2HCl，简称NEDD)反应生成粉红色络合物，在波长550 nm处测定其吸光度，其吸光度大小与硝酸根离子浓度成正比，从而测定硝态氮含量。连续流动分析仪法采用自动化分析，人为因素干扰较小，精度高、重现性好、能大幅度提高分析速度，更适用于批量样品的分析，广泛应用于土壤[8]、水体[9]中硝态氮的测定，但有关肥料中硝态氮的测定还不多见。本文选择6个不同的水溶肥料样品，探讨利用连续流动分析仪测定其中硝态氮的含量，将其测定结果与紫外分光光度法测定结果进行对比分析，以为生产和科研中硝态氮的测定提供参考。

1 实验部分

1.1 试样制备

试验样品选取了含腐植酸水溶肥料、有机水溶肥料、微量元素水溶肥料、大量元素水溶肥料4类，样品6个，其中固体样品2个，液体样品4个，分别编号为S1，L2，L3，L4，S5，L6。固体样品缩分至约100 g，将其迅速研磨至全部通过0.50 mm孔径实验筛，混合均匀，置于洁净、干燥容器中；液体样品经多次摇动后，迅速取出约100 mL，置于洁净、干燥容器中。

1.2 仪器设备

AutoAnaLyzer 3连续流动分析仪(SeaLAnaLyticaLGmbh)；UV-2501PC紫外分光光度计(SHIMEDZU)；Y JY-2112F振荡器(恒宇分析仪器有限公司)；XS105 DU分析天平(感量为0.000 1 g，METTLER TOLEDO)。

1.3 主要试剂

盐酸溶液(1+1)、实验用水均为三级水。

硝态氮标准溶液(2.5 g/L)：准确称取9.022 5 g 于 120 ℃干燥至恒重的硝酸钾于50 mL烧杯中，用水溶解后移入500 mL容量瓶中，定容，混匀，备用。

显色剂：称取10 g磺胺、0.5 g NEDD 溶解于600 mL蒸馏水中，待完全混合后，加入100 mL磷酸，并用蒸馏水定容至1 000 mL，混匀，用棕色试剂瓶避光储存。

氢氧化钠试剂：将10 g氢氧化钠溶于600 mL蒸馏水中，加入3 mL磷酸，完全混合后，用蒸馏水定容至1 000 mL，再加1 mL Brij-35助化剂(进口表面活性剂，润滑泵管)混合均匀。保持溶液清洁，可持续使用。

硫酸肼试剂：在600 mL蒸馏水中分别加入10 mL硫酸铜溶液(1 g/L)、10 mL硫酸锌溶液(10 g/L)和2 g硫酸肼，定容至1 000 mL。每周制备新鲜试剂。

1.4 样品浸提

称取试样1.0 g(精确至0.000 1 g)于250 mL容量瓶中，加入25 mL水和25 mL盐酸溶液(1+1)，混合，静置至无气体放出。加入约100 mL水，在振荡器上振荡30 min(振荡频率以容量瓶内试样能自由翻动即可)。加水定容，混匀，干过滤，待测。

1.5 测定

浸提液直接或稀释后注入连续流动分析仪自动进样系统。连续流动分析仪测定试样中硝态氮的原理是在碱性条件下，NO3-—N 被硫酸肼还原成NO2-—N，然后与对氨基苯磺酰胺生成重氮盐，再与N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(NEDD)偶联生成粉红色的化合物，测定吸光值。流动分析仪设置进样速率30样/h，蠕动泵泵速25 r/min，进样与清洗比为 3.0∶1，进样时间90 s，清洗时间30 s。仪器默认设置基线和漂移校正，自动基线参比为 4%；比色滤光片波长为550 nm，灯强度大于 l 000 mV。

紫外分光光度计测定硝态氮原理是利用硝酸根发色团在紫外区210 nm附近有明显吸收且吸光度与硝酸根离子浓度成正比的特性，测定硝态氮含量。测定使用1 cm比色皿，以0 mg/L为标准溶液调零，将浸提液稀释至合适浓度，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 显色剂的稳定时间

硫酸肼作为还原剂将NO3-—N还原成NO2-—N，然后与显色剂反应生成粉红色的化合物。实验中发现，硫酸肼放置一段时间后，会影响显色效果，使得标准曲线相关性差，故对其在放置不同时间的还原能力进行验证。用不同放置时间的硫酸肼测定标准曲线，其结果如表1所示。结果表明，硫酸肼在放置过程中，其还原能力会逐渐下降，因此适宜的线性范围最高浓度会逐渐减小，所以标准曲线线性相关系数R2值下降，测定的准确度降低。因此，最好使用冷藏保存未超过7 d的硫酸肼。

表1 硫酸肼不同放置时间测定NO3-—N的 测定结果

2.2 泵速优化

连续流动分析仪测定试样中硝态氮可使试样溶液与试剂在管路内充分混合反应，但其导致检测时间较长，为了提高实验效率，本实验对泵速进行了优化。保持其他测定条件不变，分别设置泵速为 10、12、15、20、25、30 r/min，依次测定硝态氮的浓度为200 mg/L标准溶液的吸光度。结果表明，随着泵速增大，吸光度显著提高，当泵速达到 25 r/min 时，吸光度信号最强，之后趋于平缓。

2.3 进样时间的优化

在保证完全反应的基础上，逐步缩短进样时间，以吸光度峰高稳定为最佳的进样时间。分别设置进样时间为 20、40、60、80、100、120 s，依次测定硝态氮的浓度为200 mg/L标准溶液的吸光度。结果表明，随着进样时间的延长，峰高不断提高，在 80 s 后峰高逐渐趋于平缓(图1)。

图1 进样时间与峰高关系曲线Figure 1 Correlation curve between injection time and peak height.

2.4 标准工作曲线的测定

选择硝态氮的浓度分别为0、25、50、100、200 mg/L，仪器测定的信号值峰高与标准溶液 NO3-—N浓度之间进行线性回归，制作校准曲线如图2示，0～200 mg/L范围内标准工作曲线的回归方程为y=300.97x+3853.4，R2=0.9992，满足测定需要。

图2 硝态氮含量测定标准曲线Figure 2 Standard curve for determination of nitrate nitrogen content.

2.5 检出限

检出限的计算方法是用空白试剂进行多次(n>10)测定，测得数据如图3所示。根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)检出限测定方法[10]，计算空白溶液测定结果的标准方差SD，并根据标准计算出检出限MLD=3×SD，可得连续流动分析仪法的仪器检出限为0.032 mg/L，按照称取试样1.000 0 g溶于250 mL容量瓶计算，方法检出限为0.008 g/kg。

图3 空白溶液硝态氮含量结果Figure 3 Results of nitrate nitrogen content in blank solution.

2.6 方法的精密度实验

选择水溶肥料样品S1、S2、S3、S4、S5、S6，开展平行重复实验，每个样品做6组平行，依次利用连续流动分析仪测出相应的硝态氮(NO3-—N)浓度，测定结果如表2所示。结果表明，测定结果相对标准偏差(RSD，n=6)在1.7%～8.3%，未出现较大偏差。

表2 连续流动分析仪测定结果

2.7 加标回收实验

向6个水溶肥料试样中加入一定量的硝态氮(NO3-—N)标准溶液，利用连续流动分析仪进行回收率的测定，计算加标回收率，测定结果如表3所示。结果表明，加标回收率在93.2%～101%，表明该方法准确度较好。

表3 回收率测定结果

2.8 样品测定与方法比较

6个试样分别进行6个平行浸提，浸提液分别利用连续流动分析仪法和紫外分光光度法对其中硝态氮(NO3-—N)进行测定，分别得到36个测定数据(图4)。两种方法测定硝态氮(NO3-—N)含量范围分别为0.01%～13.06%和0.03%～12.79%。t检验的双尾P值小于 0.05(表4)，表明两种方法测定结果之间无显著性差异[11]。

2.9 相关性分析

将紫外分光光度法和连续流动分析仪的测定结果进行相关性分析(图5)。两种方法测定数据之间拟合方程为y=0.9782x+0.0768，R2=0.9966，其中x为连续流动分析仪测定硝态氮含量，y为紫外分光光度计测定硝态氮含量，两种方法的测定结果之间呈现较好的一致性。

图4 连续流动分析仪法与紫外分光光度法 测定肥料样品中硝态氮(NO3-—N)结果比较Figure 4 Comparison of the results of continuous flow analyzer method and ultraviolet spectrophotometric method for determination of nitrate nitrogen (NO3-—N) in fertilizer samples.

表4 t检验-成对双样本均值比较分析连续流动 分析仪法与紫外分光光度法测定结果

图5 不同方法测定硝态氮含量之间相关性分析Figure 5 Correlation analysis between different methods of determining nitrate nitrogen content.

3 结论

利用连续流动分析仪在波长550 nm处测定水溶肥料中硝态氮的含量。从标准曲线可以看出，流动分析仪法有很好的线性关系。通过对硫酸肼和显色剂的稳定时间、泵速、进样时间等实验条件进行优化，选取了最佳检测条件，提高了检测效率。同时测定结果表明，检出限为0.032 mg/L，方法检出限为0.008 g/kg，回收率在93.3%～101%，符合正常的分析范围，说明本实验具有一定的准确度；测定结果的相对标准偏差在1.7%～8.3%，符合正常分析范围，说明本实验具有一定的精密度；所得数据与紫外分光光度计测定结果对比分析，t检验结果表明两种方法无显著差异，两种方法测定数据之间拟合方程为y=0.9782x+0.0768，R2=0.9966，线性相关性较高。

综上所述，采用连续流动分析仪法测定水溶肥料中硝态氮的方法是可行的。此方法由电脑控制进行进样测定，分析速度快，消耗试剂少，准确度与精确度较高，适用于大批量的水溶肥料样品硝态氮含量的测定。