miR-338-5p调控TRPC1对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

马亚军 吴宝恩 任可一 高秋芳 兰阿峰

瘢痕疙瘩常生长于正常皮肤上扩张超过原始伤口的边缘，并伴有疼痛、畸形等症状，瘢痕疙瘩复发率高且术后畸形偏多，因而急需研发新型治疗方法[1,2]。miRNA可参与瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖等生物学过程[3,4]。miR-338-5p通过靶向FERMT2抑制食道鳞状细胞的细胞增殖、集落形成及迁移[5]。但miR-338-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为的影响尚未阐明。Targetscan7.2预测显示miR-338-5p与TRPC1存在结合位点，研究发现TRPC1在结肠癌中表达水平升高，并可能参与结肠癌发生过程[6]。但miR-338-5p是否可调控TRPC1表达而影响瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖以及胶原合成尚未可知。因此，本研究主要探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-338-5p与TRPC1的表达及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 收集2018年3月至2019年5月于本院皮肤科、眼耳鼻喉科、普外科体表皮肤瘢痕疙瘩30例患者的瘢痕疙瘩标本，同时收集30例皮脂腺囊肿周边的正常皮肤组织，参照文献[7]分离培养正常皮肤成纤维细胞NFB与人瘢痕疙瘩成纤维细胞KFB。Lipofectamine2000试剂、Trizol试剂购自美国Invitrogen；反转录与SYBR Green试剂购自北京天根生化；miR-NC、miR-338-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-338-5p购自广州锐博生物；pcDNA购自上海吉玛制药；MTT试剂购自北京索莱宝；兔抗人TRPC1抗体购自武汉艾美捷；兔抗人CyclinD1购自美国Santa Cruz；兔抗人Col-Ⅰ、Col-Ⅲ抗体购自美国Proteintech；二抗购自美国Abcam。

1.2 方法

1.2.1 实验分组:取对数生长期KFB细胞(2.5×105个/ml)接种于96孔板(100 μl/孔)，miR-NC、miR-338-5p mimics、pcDNA-NC、pcDNA-TRPC1、miR-338-5p mimics与pcDNA-NC、miR-338-5p mimics与pcDNA-TRPC1转染入KFB细胞，于培养箱内继续培养48 h后收集细胞，分别记为miR-NC组、miR-338-5p组、pcDNA-NC组、pcDNA-TRPC1组、miR-338-5p+pcDNA-NC组、miR-338-5p+pcDNA-TRPC1组。同时将正常培养的KFB细胞作为NC组。

1.2.2 qRT-PCR检测细胞中miR-338-5p、TRPC1 mRNA的表达水平:采用Trizol法提取NFB、KFB细胞与转染后的各组KFB细胞总RNA，RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增体系按照试剂盒说明书操作，应用美国ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪检测miR-338-5p、TRPC1 mRNA相对表达量。

1.2.3 MTT检测细胞增殖：收集各组KFB细胞(1×105个/ml)接种于96孔板(100 μl/孔)，每孔加入20 μl MTT溶液，将其置于培养箱内继续培养4 h后弃上清，每孔加入150 μl DMSO，室温避光孵育5 min后应用酶标仪检测各孔吸光度值(A值)。

1.2.4 双荧光素酶报告基因检测miR-338-5p与TRPC1的靶向关系:Targetscan7.2预测显示miR-338-5p与TRPC1存在结合位点，构建野生型载体TRPC1-3’UTR-WT、突变型载体TRPC1-3’UTR-MUT，miR-NC、miR-338-5p mimics分别与TRPC1-3’UTR-WT、TRPC1-3’UTR-MUT共转染入KFB细胞，将其置于培养箱内继续培养24 h后收集细胞并检测相对荧光素酶活性。

1.2.5 Western blot检测TRPC1、CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达:收集NFB、KFB细胞与转染后各组KFB细胞加入400 μl RIPA裂解液提取细胞总蛋白，将5×SDS上样缓冲液加入其中后置于沸水中煮10 min，蛋白变性，取40 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳反应，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜后使用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入1∶1 000稀释比的一抗与内参一抗(1∶1 000)，加入1∶5 000稀释比的二抗，滴加ECL，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 人瘢痕疙瘩成纤维细胞中，miR-338-5p、TRPC1的表达情况 与NFB细胞比较，KFB细胞中miR-338-5p的表达水平降低(P<0.05)，TRPC1 mRNA及蛋白水平升高(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western Blot检测TRPC1

表1 人瘢痕疙瘩成纤维细胞中 miR-338-5p和TRPC1表达量

2.2 高表达miR-338-5p抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成 与miR-NC组比较，miR-338-5p组细胞活力降低(P<0.05)，CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白水平降低(P<0.05)。见表2，图2。

表2 低表达miR-338-5p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响

图2 Western Blot检测CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表达

2.3 高表达TRPC1促进人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成 与pcDNA-NC组比较，pcDNA-TRPC1组细胞活力升高(P<0.05)，CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白水平升高(P<0.05)。见图3，表3。

图3 Western Blot检测TRPC1、CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表达

表3 高表达TRPC1促进人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成

2.4 miR-338-5p靶向TRPC1 Targetscan7.2预测显示miR-338-5p与TRPC1存在结合位点。miR-338-5p过表达可降低野生型载体TRPC1-3’UTR-WT的荧光素酶活性(P<0.05)，而对突变型载体TRPC1-3’UTR-MUT的荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)。与miR-NC组比较，miR-338-5p组TRPC1蛋白水平降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-338-5p组TRPC1蛋白水平升高(P<0.05)。见表4、5，图4。

表4 miR-NC或miR-338-5p与TRPC1-3’UTR野生型及突变型报告质粒共转染瘢痕疙瘩成纤维细胞瘢痕疙瘩成纤维细胞后双荧光素酶活性检测

表5 Western Blot检测TRPC1 的表达

图4 miR-338-5p靶向TRPC1;A Targetscan7.2对TRPC1和miR-338-5p结合进行预测示意图;B Western Blot检测TRPC1蛋白的表达

2.5 高表达TRPC1可以逆转miR-338-5p高表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成的抑制作用 与miR-338-5p+pcDNA-NC组比较，miR-338-5p+pcDNA-TRPC1组细胞活力升高(P<0.05)，CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白水平升高(P<0.05)。见图5，表6。

图5 Western Blot检测TRPC1、CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达

表6 高表达TRPC1可以逆转miR-338-5p高表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成的抑制作用

3 讨论

研究证实，miRNA在瘢痕疙瘩中表达异常并可参与瘢痕疙瘩的发生及发展过程，还可能作为瘢痕疙瘩潜在的治疗靶标，例如，miR-21通过靶向FasL，通过caspase-8和线粒体介导的凋亡信号通路调节瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡[8]。miR-181a靶向PHLPP2以增强AKT信号传导并调节瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和凋亡[9]。miR-152-5p通过调节Smad3的表达而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移并促进凋亡[10]。但仍有部分miRNA在瘢痕疙瘩形成过程中的作用机制尚未阐明。

miR-338-5p通过靶向ADAMTS-9而抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的增殖和侵袭[11]。miR-338-5p通过直接靶向EFEMP1抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移、侵袭并促进其凋亡[12]。但miR-338-5p在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达尚未可知。本研究结果提示miR-338-5p在瘢痕疙瘩形成过程中可能发挥调控作用，miR-338-5p过表达可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。Col-Ⅰ、Col-Ⅲ是细胞外基质的主要成分，抑制Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达可有效减少细胞外基质的沉积[13,14]。本研究结果显示miR-338-5p过表达可能通过抑制胶原蛋白合成从而抑制瘢痕疙瘩的形成。

本研究证实miR-338-5p可靶向结合TRPC1，并可负向调控TRPC1的表达。TRPC1/3/6抑制通过Ras/Raf1/ERK信号通路减弱TGF-β1诱导的胃癌上皮-间质转化[15]。TRPC1在多发性骨髓瘤、婴儿血管瘤等肿瘤中表达上调，并可能参与肿瘤发生及发展过程[16,17]。本研究结果提示TRPC1过表达可促进瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖以及胶原合成。同时本研究采用miR-338-5p过表达与TRPC1过表达联合处理瘢痕疙瘩成纤维细胞，结果提示TRPC1过表达可明显逆转miR-338-5p过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖以及胶原合成的作用。

综上所述，瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-338-5p的表达水平降低，而TRPC1的表达水平升高，miR-338-5p过表达可通过下调TRPC1表达而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原蛋白合成从而抑制瘢痕疙瘩的形成，可为进一步揭示瘢痕疙瘩形成的分子机制奠定实验基础，miR-338-5p/TRPC1还可能作为瘢痕疙瘩治疗的潜在靶标。