喉癌组织中miR-340-5p、c-Myc、TCF-4 的表达及临床意义

周海婷 赵 瑜 邱 影

盘锦辽油宝石花医院耳鼻喉科，辽宁盘锦 124010

喉癌是常见的头颈部肿瘤，我国每年喉癌新发患者例数约有2.6 万例，死亡约1.5 万例[1]。目前喉癌的主要治疗是手术及放化疗等。但部分患者起病隐匿，部分患者发现时已为中晚期，往往需行全喉切除，患者生存时间较短[2]。揭示喉癌发生发展的机制对临床治疗意义较大。微RNA（microRNA，miRNA）是长度为19～25 个核苷酸的非编码RNA，转录后调控靶基因信使RNA 的稳定性，影响基因的表达。miRNA 是参与恶性肿瘤进展的重要调节分子，对肿瘤的增殖、凋亡、浸润及转移等生物学过程都有影响[3]。miR-340-5p 的编码基因位于5q35.3，研究发现在胶质瘤[4]、肺癌[5]等多种肿瘤中均存在异常表达的现象，其异常表达促进肿瘤的恶性进展。肿瘤的发生与癌基因的过度激活有关，c-Myc 是一种原癌基因，编码一种核内磷酸化蛋白，在细胞周期、凋亡和细胞转化中起调控作用。其编码蛋白形成异源二聚体，与特定靶基因E 盒DNA 共有序列结合影响基因的转录。大量研究发现，在许多人类恶性肿瘤中均发现该基因的异常扩增的现象[6]。转录因子-4（transcription factor-4，TCF-4）基因位于18q21.2，该基因编码蛋白是一种螺旋-环-螺旋TCF，能识别靶基因E 盒结合位点，在神经系统发育中起重要作用。研究表明，miR-340-5p 可以靶向调节c-Myc、TCF-4 表达参与癌症进展[7]。因此，本研究通过研究喉癌患者癌组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表达，初步研究三者的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年2 月至2020 年11 月盘锦辽油宝石花医院（以下简称“我院”）诊治的102 例喉癌患者作为本研究的研究对象。纳入标准：①经病理学检查明确诊断为喉鳞状细胞癌。②一般身体状况良好，Karnofsky 评分>70 分。③一般资料完整。排除标准：①合并其他器官恶性肿瘤。②合并感染性疾病、自身免疫性疾病及精神障碍性疾病等。③合并严重的心肺等脏器功能障碍。④有放化疗治疗史。102 例喉癌患者中，男77 例，女25 例；年龄28～77 岁，平均（57.4±10.8）岁；肿瘤位置：声门型44 例，声门上型40 例，声门下型18 例；肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期患者69 例，Ⅲ～Ⅳ期患者33 例；肿瘤分化高分化患者21 例，中、低分化患者81 例；淋巴结转移：有50 例，无52 例。患者对本研究已知情并签署同意书，本研究已经我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 检测方法

1.2.1 实验材料 总RNA 提取试剂盒购自北京索莱宝公司，货号：R1200。逆转录试剂盒购自北京索莱宝公司，货号：T2240。2×SYBR Green PCR Mastermix 试剂盒购自北京索莱宝公司，货号：SR1110。引物序列由上海生工公司设计及合成。

1.2.2 应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real time fluorescence quantitative reserve transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）法检测miR-340-5p、c-Myc及TCF-4的表达Trizol法提取癌和癌旁组织中总RNA，焦碳酸二乙酯水溶解后检测RNA的浓度，逆转录为cDNA。qRT-PCR总反应体系20μl，10μlSYBRGreenPremix，正反向引物各1μl，cDNA2μl，DEPC水6μl。miR-340-5p正向引物序列：5’-ATATATTCCTATCAGTCTGTTT-3’，反向引物序列：5’-GTCCTCACTGATGCCCAGTT-3’，miR-340-5p以U6为内参，内参基因U6正向引物序列：5’-CGC-TTCGGCAGCACATATACTAA-3’，反向引物序列：5’-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3’；c-Myc正向引物序列：5’-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3’，反向引物序列：5’-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3’；TCF-4正向引物序列：5’-CAAGCACTGCCGACTACAATA-3’，反向引物序列：5’-CCAGGCTGATTCATCCCACTG-3’；c-Myc及TCF-4 以GAPDH 为内参，内参基因GAPDH正向引物序列：5’-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’，反向引物序列：5’-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3’。miR-340-5p 的qPCR 反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40 个循环。c-Myc及TCF-4 的qRT-PCR 反应条件为：94℃5 min，94℃20 s，60℃25 s，70℃34 s，共39 个循环。miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表达水平以相对定量法2-ΔΔCt值表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t检验；计数资料采用例数或百分率表示，比较采用χ2检验。miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 之间的相关性分析采用Pearson 线性相关分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌和癌旁组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4的相对表达量比较

与癌旁组织比较，癌组织中miR-340-5p 的相对表达量明显降低，而c-Myc、TCF-4 的相对表达量明显升高（P ＜0.05）。见表1。

表1 癌和癌旁组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的相对表达量比较（）

表1 癌和癌旁组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的相对表达量比较（）

注 miR-340-5p：微RNA-340-5p；TCF-4：转录因子4

2.2 癌组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表达与临床病理特征的关系

不同肿瘤分期的喉癌组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表达，差异有统计学意义（P ＜0.05）；不同年龄、性别、分型、肿瘤分化程度及是否伴有淋巴结转移比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 癌组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表达与临床病理特征的关系（）

表2 癌组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表达与临床病理特征的关系（）

注 miR-340-5p：微RNA -340-5p；TCF-4：转录因子4

2.3 癌组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表达的相关性

Pearson 线性相关分析结果显示，miR-340-5p 和c-Myc、TCF-4 的表达呈负相关（r=-0.549、-0.452，P=0.000、0.000），而c-Myc与TCF-4 表达无相关性（r=0.167，P=0.094）。见图1。

图1 癌组织中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表达的相关性

3 讨论

喉癌是我国常见的恶性肿瘤之一，喉鳞状细胞癌是最常见的病理类型，腺癌等类型较为少见。喉癌发病位置特殊，随着肿瘤进展，会影响患者发音及呼吸吞咽等喉部正常功能。因此，针对喉癌的治疗会不同程度影响喉部正常生理功能[8]。深入研究喉癌的发病机制，有助于寻找早期诊断喉癌或判断预后的肿瘤标志物。喉癌的发生受遗传、环境等多种因素的影响，如吸烟、饮酒及职业暴漏等因素。喉癌的发生发展是一个多阶段、多机制的过程，涉及癌基因的激活、抑癌基因的失活等改变[9]。因此，寻找喉癌关键的致病癌基因或抑癌基因及其调控机制，对临床诊断及治疗具有重要意义。

以往认为，非编码RNA 如miRNA、长非编码RNA 等是转录过程中的转录噪音，而近年来发现，miRNA 可特异性结合下游靶基因mRNA 的3’-非编码区，影响mRNA 的稳定性，调控多种靶基因的表达，与肿瘤、自身免疫性疾病等多种人类疾病密切相关，有望成为早期诊断喉癌的肿瘤标志物[10-11]。本研究显示，癌组织中miR-340-5p 表达降低，提示miR-340-5p 在喉癌中发挥抑癌基因的作用。目前喉癌中miR-340-5p 表达下调的机制不明，结合以往研究，推测与长链非编码RNA 对miR-340-5p 表达调控有关。如长链非编码RNA LINC00662，可作为分子海绵或分子支架直接结合miR-340-5p，同时抑制miR-340-5p 的表达，促进肿瘤的增殖及侵袭，而在体外细胞实验中发现肿瘤细胞中敲除LINC00662 后，miR-340-5p 表达水平升高，肿瘤的增殖及侵袭能力降低[12]。本研究结果显示，癌组织中miR-340-5p 的表达与肿瘤TNM 分期有关，提示miR-340-5p 表达降低参与促进喉癌的进展。有研究报道，miR-340-5p通过靶向抑制多聚梳抑制复合体2 的表达，进而抑制磷脂酰肌醇3 激酶/AKT 信号通路的过度激活，抑制肿瘤细胞的过度增殖，而miR-340-5p 表达降低导致肿瘤细胞的过度增殖及凋亡减少，引起肿瘤分期升高[13]。

肿瘤的发生发展与癌基因的过度激活有关。c-Myc及TCF-4 是常见的原癌基因，在多种人类肿瘤中均表现为过度表达的现象，促进肿瘤的增殖、凋亡、浸润及转移等生物学行为[6-7]。本研究中，喉癌癌组织中c-Myc、TCF-4 的相对表达量均明显高于癌旁组织。分析其原因，一方面，c-Myc 表达增加与c-Myc癌基因扩增有关，研究表明，多种肿瘤中均存在c-Myc基因扩增的现象，导致c-Myc 表达水平升高[14]。另一方面，TCF-4 表达同时受到转录后调控。有学者发现，miR-139 可结合并抑制TCF-4 的表达，而癌细胞miR-139 异常表达下调促进肿瘤细胞的增殖及浸润[15]，此外，c-Myc、TCF-4 的表达与较高的肿瘤TNM 分期有关。首先，c-Myc 作为一种螺旋-环-螺旋结构的TCF，是促进细胞增殖关键因子，其表达水平升高能够促进细胞周期进程，导致肿瘤细胞无限增殖，促进肿瘤的恶性进展[16-17]。此外，研究表明，TCF-4 能够与β-连环蛋白结合形成二聚体，促进单核细胞趋化蛋白1 的表达，其表达水平增加导致肿瘤微环境处于免疫耐受的状态，促进肿瘤的增殖、侵袭及血管生成，导致肿瘤分期升高[18-19]。

本研究中，癌组织中miR-340-5p与c-Myc、TCF-4 表达呈负相关，其机制可能与miR-340-5p 对c-Myc、TCF-4 基因表达调控有关。有学者在体外细胞实验中亦证实miR-340-5p与c-Myc、TCF-4 表达呈负相关，喉癌Hep2 细胞系中miR-340-5p 表达较低，c-Myc、TCF-4 的表达较高，而在过表达miR-340-5p后，c-Myc 和TCF-4 的表达水平均显著降低[20-22]。目前喉癌中miR-340-5p 对c-Myc、TCF-4 表达的调控机制尚不清楚。Rongxin等[23]、Zhang等[24]对骨肉瘤的研究表明，信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription3，STAT3）是miR-340-5p 的直接作用靶点，肿瘤中miR-340-5p 的低表达导致STAT3 表达上调，激活Wnt/β 连环蛋白通路，促进c-Myc、TCF-4 的表达。此外，大量文献亦证实，STAT3 能够直接促进细胞中c-Myc、TCF-4 基因的表达，促进肿瘤的恶性进展[25-27]。因此，c-Myc、TCF-4 表达的表达可能受到miR-340-5p 的间接调控，进而影响肿瘤细胞增殖及侵袭能力。

综上所述，喉癌组织中miR-340-5p 表达降低，而c-Myc及TCF-4 表达升高，miR-340-5p 表达与c-Myc及TCF-4 呈负相关，三者共同促进喉癌的肿瘤进展，有望成为新的诊断及治疗喉癌靶点的潜能，值得深入探索。